Étude de l'angiogenèse et de la distribution des cellules souches mésenchymateuses dans des défauts ostéochondraux chez le lapin

Les défis majeurs de la recherche orthopédique actuelle sont la restauration, le maintien et l'amélioration des tissus du système musculo-squelettique, afin de remédier aux déficiences causées par des maladies, telles que l'arthrite rhumatoïde et l'arthrose. En 2011, plus de 16 % de la population canadienne recensée souffrait de ces maladies, ayant donc à endurer des douleurs articulaires et une mobilité réduite des articulations affectées. À cause de l'absence de vaisseaux sanguins dans le cartilage et la faible densité cellulaire, le processus de réparation tissulaire n'est amorcé que difficilement au niveau de lésions du cartilage. Diverses techniques chirurgicales ont donc été développées pour stimuler la réparation ou la régénération du cartilage, incluant par exemple les transplantations de chondrocytes autologues et les techniques de stimulation de la moelle osseuse. Ces dernières sont parmi les plus utilisées et la stimulation de la moelle osseuse définit des techniques chirurgicales basées sur la microfracture ou la microperforation du cartilage et de l'os sous-jacent. Dans ce cas, la réparation est possible grâce à la création de canaux, qui permet la formation d'un caillot sanguin et l'infiltration des cellules souches mésenchymateuses, à partir des dommages causés au système vasculaire de l'os sous-chondral. Cependant, de nombreuses études ont démontré que le cartilage résultant était un mélange de cartilage hyalin et de cartilage fibreux, dont les propriétés mécaniques sont insuffisantes pour restaurer la mobilité initiale de l'articulation. Comme montrée dans de précédents travaux entrepris au laboratoire, la combinaison des techniques de microperforation avec un implant composé de chitosan, de glycérolphosphate et de sang autologue permet d'améliorer la qualité du cartilage réparé. Ceci est possible grâce au recrutement de plusieurs populations cellulaire au site de la lésion, comme les neutrophiles et les macrophages, et à travers divers mécanismes biologiques, incluant l'angiogenèse et la chondrogenèse. Il a été démontré que la solidification in situ de l'implant pouvait être accélérée par l'ajout de facteurs de coagulation. Les facteurs testés sont la thrombine (IIa), le facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et le facteur tissulaire (TF). Ils ont été ajoutés à l'implant chitosan-GP/sang, afin d'accélérer la solidification in situ au cours de l'application clinique , qui pourrait rendre possible la livraison de l'implant par arthroscopie. Dans un modèle lapin de microperforation, l'implant chitosan-GP/sang solidifié in situ par la thrombine permet d'améliorer la qualité du cartilage réparé vis-avis la thrombine seule (Marchand et al., 2012). Cependant, l'effet précis des facteurs de coagulation sur l'angiogenèse et les mécanismes de réparation tissulaire doivent encore être étudiés. Dans cette étude, les deux hypothèses suivantes sont posées : - L'ajout de facteurs de coagulation, notamment la thrombine (IIa), le facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et le facteur tissulaire (TF) + rhFVIIa, à la solution de chitosan, de glycérolphosphate et de sang autologue, engendre plus d'angiogenèse dans l'os sous-chondral des microperforations en réparation par rapport à la microperforation seule, à 3 semaines postchirurgie dans un modèle lapin de la stimulation de la moelle. - L'utilisation de l'implant chitosan-GP/sang, avec les techniques de stimulation de la moelle osseuse, attire un plus grand nombre de cellules souches mésenchymateuses (MSC) aux lésions microperforées, comparativement à l'utilisation des techniques de stimulation de la moelle osseuse seules. Pour répondre à ces hypothèses, les objectifs de cette étude sont les suivants : - Évaluer l'effet de l'implant chitosan-GP/sang coagulé dans la lésion avec la thrombine (IIa), du facteur VIIa recombiné humain (rhFVIIa) et du facteur tissulaire (TF) + rhFVIIa sur la réparation du cartilage induite par la microperforation, par rapport à la microperforation seule, à partir de la quantification stéréographique des vaisseaux sanguins et des données histomorphométriques de la matrice extracellulaire du tissu de granulation; - Proposer des anticorps qui se lient aux cellules souches humaines et qui peuvent être utilisés en immunohistochimie pour détecter des MSC dans les tissus de lapin NZW et dans des coupes osteochondrales; - Localiser les MSC dans les lésions microperforées dans le cartilage, pour une meilleure compréhension du processus de réparation du cartilage. Dans la première partie de ce projet de mémoire, l'effet de l'implant chitosan-GP/sang avec ou sans un facteur de coagulation a été étudié à travers une méthode stéréographique. Cette dernière permet de récolter des données quantitatives reproductibles, qui peuvent être comparées aux données d'études passées et d'études futures. L'augmentation de la densité de surface et de volume des vaisseaux sanguins pour des implants avec IIa ou rhFVIIa ajouté montrent que ces facteurs de coagulation peuvent stimuler plus d'angiogenèse dans l'os sous-chondral au cours de la réparation induite par microperforation. Il a également été démontré que l'implant chitosan-GP/sang retarde le dépôt des fibres de collagènes (de type I et de type II) dans la matrice extracellulaire. Dans la deuxième partie de ce mémoire, les anticorps contre la β-catenin, la nestin et l'actine αSMA ont été utilisés pour des tests d'immunohistochimie, afin de détecter les cellules souches mésenchymateuses dans les tissus d'études animales in vivo. Malgré l'absence de signal positif avec les anticorps anti-β-catenin et anti-nestin, l'actine αSMA a été détectée dans divers tissus du lapin NZW, incluant les tissus fœtaux, les tissus adultes du foie, du poumon, de la peau, du placenta, de la trochlée intacte ou en réparation. Les résultats obtenus dans les tissus de trochlée en réparation montrent que les cellules exprimant l'actine αSMA sont localisées sur les bords de la microperforation, ainsi qu'à la surface du tissu de granulation. Bien que des tests supplémentaires soient nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes impliquant les MSC, les colorations IHC effectuées indiquent que les cellules αSMA-positives sont des « bone lining cells » et qu'elles sont impliquées dans le processus de remodelage et réparation de l'os, et dans les « pre-chondrogenic foci » survenant à l'intersection du tissu de granulation et de l'os nouvellement formé. Les pre-chondrogenic foci, qui sont formés à la surface des plaques sous-chondrales, sont les structures précoces du cartilage articulaire régénéré. Dans son ensemble, cette étude a permis des informations supplémentaires sur l'implication de l'angiogenèse et des cellules souches mésenchymateuses lors de la réparation du cartilage et de l'os sous-chondral. Elle bénéficie aux progrès de la recherche dans ce domaine en démontrant que l'angiogenèse et les MSC sont des éléments détectable et quantifiable dans le tissu de granulation des lésions microperforées du cartilage, avant l'émergence des « chondrogenic foci ». Des études futures devraient être en mesure d'optimiser l'implant chitosan-GP/sang par la sélection d'additifs, comme les facteurs de coagulation, qui peuvent améliorer l'efficacité et la durabilité de la réparation du cartilage. L'un des buts majeurs est de pouvoir engendrer la formation d'un cartilage « purement » hyalin à travers la promotion de l'angiogenèse et du recrutement des MSC pour restituer le cartilage à son état sain initial.