Afficheurs microfluidiques comme outil d'étude des voies de signalisation cellulaires en biologie des systèmes

L'étude de la signalisation cellulaire est de première importance pour l'approfondissement des connaissances fondamentales en biologie des systèmes, mais aussi pour le développement de nouveaux traitements dans le cas de maladies où les voies de signalisation sont déréglées. Il est maintenant acquis que les cellules ont la capacité d'utiliser la dynamique afin d'encoder les signaux en provenance de leur environnement. C'est-à-dire que la façon dont la concentration des protéines de signalisation varie dans le temps influence l'expression des gènes en aval et donc le destin de la cellule. Pour étudier la dynamique de signalisation cellulaire, il faut recourir à des méthodes qui permettent de stimuler en fréquence les voies de signalisation avec une haute résolution temporelle tout en permettant idéalement une analyse multiplexée. Parmi les techniques couramment utilisées, on retrouve les systèmes microfluidiques sur puce ou encore les systèmes optogénétiques. Toutefois, l'étude de la dynamique de signalisation cellulaire représente toujours un défi pour les chercheurs en raison de la complexité liée à la perturbation dynamique des voies de signalisation. Il se trouve qu'une récente technologie en microfluidique ouverte aurait le potentiel de faciliter et d'accélérer les recherches sur la dynamique de communication des cellules. Il s'agit des afficheurs microfluidiques, soient des dispositifs qui, à l'aide de canaux verticaux, injectent et aspirent des fluides sur une surface ouverte afin de créer différents motifs d'écoulement, et ce, avec une grande précision spatiale et temporelle. L'objectif du présent travail était de caractériser les performances des afficheurs microfluidiques pour la stimulation dynamique et l'analyse de voies de signalisations cellulaires. D'abord, les techniques de design et de fabrication des afficheurs microfluidiques ont été reprises pour la conception d'un dispositif adapté à l'utilisation en culture cellulaire. La configuration retenue est celle de type fleur, où les injections se répartissent en cercle autour d'une ouverture d'aspiration commune pour former des écoulements en forme de pétales. Un compromis a été atteint pour limiter les forces de cisaillement au niveau des cellules, obtenir plus d'une centaine de cellules sous les zones traitées et réduire les temps de transition des injections jusqu'à environ 7s. Le projet est ensuite passé à l'étape de l'utilisation de l'afficheur microfluidique en culture cellulaire. Le système a été validé en effectuant des tests de marquage de cellules avec le fluorophore Hoechst 33258. La précision spatiale et temporelle de la livraison de réactifs auxcellules a été vérifiée expérimentalement, permettant de constater le bon fonctionnement de l'afficheur conçu et des protocoles expérimentaux développés. Des expériences ont aussi démontré que la viabilité cellulaire n'était pas affectée par l'utilisation de l'afficheur sur les cellules. En effet, la viabilité est maintenue entre 94 % et 97 %, semblable au contrôle négatif (96,93 %), pour des durées d'utilisation de 30 min, 1 h et 1 h 30, et ce, dans la plage usuelle des paramètres d'utilisation de l'afficheur. Finalement, la technologie des afficheurs a été mise à l'essai pour activer dynamiquement la voie de signalisation cellulaire Notch. D'abord, une solution d'éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) a été utilisée pour activer le récepteur Notch1 de cellules exprimant en aval la citrine, un gène rapporteur fluorescent. En utilisant l'afficheur, il a été possible d'activer la voie Notch selon 6 différents temps d'activation au sein de la même expérience et de démontrer que le niveau d'activation Notch est proportionnel au temps d'activation par EDTA. Ensuite, l'afficheur a été utilisé pour envoyer des séries de pulses d'activation aux cellules afin d'étudier la réponse en fréquence de la voie Notch au niveau de l'expression des gènes d'intérêt Hes1 et Hey1. Les résultats, bien que préliminaires, démontrent que les afficheurs microfluidiques sont bel et bien efficaces pour étudier la dynamique d'une voie de signalisation. Ce projet pave la voie à de futures recherches utilisant les afficheurs microfluidiques pour la caractérisation de la réponse en fréquence de la voie Notch, et éventuellement d'autres voies de signalisation. Les travaux présentés ont permis de faire la transition de la technologie des afficheurs microfluidiques à leur utilisation en culture cellulaire et la création de protocoles pour les expériences en biologie cellulaire.

Abstract

Due to the important and ubiquitous role of cell signaling in biology, its study is not only essential to improve fundamental knowledge, but also for the development of new drugs targeting deregulated signaling pathways in various diseases. It has emerged that cells have the ability to use dynamic properties to encode signals coming from their environment. That is to say, the way the concentration of signaling molecules varies through time impact downstream gene expression and cell fate. In order to study dynamics in cell signaling efficiently, techniques allowing to probe the cells with a high temporal resolution and in a multiplexed fashion are required. Among those techniques, there are some already successfully used such as microfluidic on-chip devices and optogenetics. However, the study of cell signaling dynamics remains a constant challenge for researchers due to the complexity of making targeted dynamic perturbations in signaling pathways. A recent technology in the field of open-space microfluidic has the potential to facilitate and accelerate research on cell dynamics, namely: the chemical microfluidic displays. These devices control the flow of a reagent over an open surface with the help of vertical channels coming out of a flat probe head. By adjusting the ratio of injection and aspiration of each aperture, it allows the confinement of fluids in various patterns with a high spatial and temporal resolution. The main objective of the present work was to characterize the performances of the microfluidic display for the dynamic stimulation and multiplexed analysis of cell signaling pathways. First, a device of this type has been designed to be suited for use in cell culture, following fabrication techniques previously developed. The chosen configuration is that of the flower type, where the injections are distributed in a circle around a common aspiration aperture, thus forming petal shapes flows. A compromised has been reached in the design to limit the shear stress on the cells, to obtain more than a hundred cells under the treated areas, and to reduce the transition times of the injections down to approximately 7 s. The next step in the project was to transition to the use of the microfluidic display in cell culture. The system has been validated by cell staining experiments using Hoechst 33258 fluorophore. The precision of spatial and temporal resolution for reagent delivery to the cells has also been experimentally verified, allowing to see the proper functioning of the display and the experimental protocols. Experiments have also shown that cell viability is not affected by the microfluidicdisplay operated over the cells. Indeed, cell viability was maintained between 94 % and 97 %, a level similar to the negative control (96,93 %), for use time of 30 min, 1 h and 1 h 30, and that under usual conditions of the display. Finally, the microfluidic display technology has been used to dynamically stimulate the Notch signaling pathway in cells. First of all, an ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution was used to activate the Notch1 receptor in cells expressing a citrine, a downstream fluorescent reporter. The Notch pathway was activated with 6 different EDTA activation time during the same experiment using the display, thus showing that the level of Notch activation is proportional to the activation time. Next, the display has been used to send series of activation pulses to cells in order to measure the Notch frequency response in the downstream gene expression of Hes1 and Hey1. The results, even though preliminary, show the microfluidic display efficiency to study cell signaling dynamics. This project paves the way for future researches using microfluidic display to study the Notch pathway frequency response, and eventually other interesting signaling pathway. The work presented has allowed the transition of the microfluidic displays to their use in cell culture, in addition of the creation of adapted protocols in cell biology.