Afficheurs microfluidiques comme outil d'étude des voies de signalisation cellulaires en biologie des systèmes

L'étude de la signalisation cellulaire est de première importance pour l'approfondissement des connaissances fondamentales en biologie des systèmes, mais aussi pour le développement de nouveaux traitements dans le cas de maladies où les voies de signalisation sont déréglées. Il est maintenant acquis que les cellules ont la capacité d'utiliser la dynamique afin d'encoder les signaux en provenance de leur environnement. C'est-à-dire que la façon dont la concentration des protéines de signalisation varie dans le temps influence l'expression des gènes en aval et donc le destin de la cellule. Pour étudier la dynamique de signalisation cellulaire, il faut recourir à des méthodes qui permettent de stimuler en fréquence les voies de signalisation avec une haute résolution temporelle tout en permettant idéalement une analyse multiplexée. Parmi les techniques couramment utilisées, on retrouve les systèmes microfluidiques sur puce ou encore les systèmes optogénétiques. Toutefois, l'étude de la dynamique de signalisation cellulaire représente toujours un défi pour les chercheurs en raison de la complexité liée à la perturbation dynamique des voies de signalisation. Il se trouve qu'une récente technologie en microfluidique ouverte aurait le potentiel de faciliter et d'accélérer les recherches sur la dynamique de communication des cellules. Il s'agit des afficheurs microfluidiques, soient des dispositifs qui, à l'aide de canaux verticaux, injectent et aspirent des fluides sur une surface ouverte afin de créer différents motifs d'écoulement, et ce, avec une grande précision spatiale et temporelle. L'objectif du présent travail était de caractériser les performances des afficheurs microfluidiques pour la stimulation dynamique et l'analyse de voies de signalisations cellulaires. D'abord, les techniques de design et de fabrication des afficheurs microfluidiques ont été reprises pour la conception d'un dispositif adapté à l'utilisation en culture cellulaire. La configuration retenue est celle de type fleur, où les injections se répartissent en cercle autour d'une ouverture d'aspiration commune pour former des écoulements en forme de pétales. Un compromis a été atteint pour limiter les forces de cisaillement au niveau des cellules, obtenir plus d'une centaine de cellules sous les zones traitées et réduire les temps de transition des injections jusqu'à environ 7s. Le projet est ensuite passé à l'étape de l'utilisation de l'afficheur microfluidique en culture cellulaire. Le système a été validé en effectuant des tests de marquage de cellules avec le fluorophore Hoechst 33258. La précision spatiale et temporelle de la livraison de réactifs auxcellules a été vérifiée expérimentalement, permettant de constater le bon fonctionnement de l'afficheur conçu et des protocoles expérimentaux développés. Des expériences ont aussi démontré que la viabilité cellulaire n'était pas affectée par l'utilisation de l'afficheur sur les cellules. En effet, la viabilité est maintenue entre 94 % et 97 %, semblable au contrôle négatif (96,93 %), pour des durées d'utilisation de 30 min, 1 h et 1 h 30, et ce, dans la plage usuelle des paramètres d'utilisation de l'afficheur. Finalement, la technologie des afficheurs a été mise à l'essai pour activer dynamiquement la voie de signalisation cellulaire Notch. D'abord, une solution d'éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) a été utilisée pour activer le récepteur Notch1 de cellules exprimant en aval la citrine, un gène rapporteur fluorescent. En utilisant l'afficheur, il a été possible d'activer la voie Notch selon 6 différents temps d'activation au sein de la même expérience et de démontrer que le niveau d'activation Notch est proportionnel au temps d'activation par EDTA. Ensuite, l'afficheur a été utilisé pour envoyer des séries de pulses d'activation aux cellules afin d'étudier la réponse en fréquence de la voie Notch au niveau de l'expression des gènes d'intérêt Hes1 et Hey1. Les résultats, bien que préliminaires, démontrent que les afficheurs microfluidiques sont bel et bien efficaces pour étudier la dynamique d'une voie de signalisation. Ce projet pave la voie à de futures recherches utilisant les afficheurs microfluidiques pour la caractérisation de la réponse en fréquence de la voie Notch, et éventuellement d'autres voies de signalisation. Les travaux présentés ont permis de faire la transition de la technologie des afficheurs microfluidiques à leur utilisation en culture cellulaire et la création de protocoles pour les expériences en biologie cellulaire.