Caractérisation d'une formulation de bactériophages libres et micro-encapsulés dans un polymère biodégradable poly(ester amide urée) pour traiter les infections d'ulcères diabétiques

Les ulcères à pression diabétiques, qui sont l'une des principales complications du diabète, sont régulièrement ciblés par des infections résistantes difficiles à traiter. Les infections d'ulcères diabétiques sont très majoritairement traitées avec des antibiotiques, mais ces traitements ne sont pas toujours efficaces et environ un quart d'entre eux échouent, augmentant ainsi les risques d'amputation, de complications et de décès. La morphologie des plaies et des biofilms, ainsi que l'augmentation de la circulation des souches résistantes aux antibiotiques dans l'environnement, limitent l'efficacité des antibiotiques à traiter efficacement ces pathologies. L'augmentation de l'importance de la résistance aux antibiotiques a induit un regain d'intérêt pour les bactériophages (des virus infectant spécifiquement les bactéries) dans la médecine occidentale. Des études ont montré le réel potentiel des bactériophages à éliminer des biofilms bactériens et à traiter des infections d'ulcères diabétiques. Les phages pourraient être une alternative aux antibiotiques pour traiter ce type d'infection. L'utilisation d'une matrice polymérique biodégradable comme véhicule des bactériophages est une stratégie envisageable, car celle-ci permet une libération prolongée de phages sur une plaie tout en les protégeant de cet environnement. Cette technologie a montré des résultats très intéressants sur un autre type de plaie chronique. La présente étude porte sur la formulation F10, développée par Phagelux Canada, composée de 14 bactériophages à la fois libres et micro-encapsulés dans un polymère biodégradable poly(ester amide urée) (PEAU). Les 14 bactériophages sont spécifiques à un grand nombre de souches de Staphylococcus aureus, Klebiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa. L'objectif principal de ce projet est de mesurer la cinétique de dégradation des microcapsules de PEAU de la formulation F10 et sa capacité à détruire des biofilms profondément ancrés dans la peau. Les objectifs secondaires sont (1) d'identifier dans la composition chimique du polymère PEAU les groupes fonctionnels ester et amide impliqués dans sa dégradation, (2) de mesurer la cinétique de dégradation des microcapsules de PEAU, (3) de mesurer la diffusion transdermique des bactériophages de la formulation dans un modèle de plaie d'ulcère diabétique et (4) de mesurer l'efficacité de la formulation à détruire un biofilm sur un modèle de plaie d'ulcère diabétique. L'identification des groupes d'intérêt du PEAU est faite par l'analyse de son spectre FTIR. La dégradation des microcapsules de PEAU, en suspension dans un tampon, est étudiée en présence ou non d'élastase de neutrophile (protéase généralement présente sur les plaies d'ulcères diabétiques), et incubée à 32°C pendant 72h. La biodégradation des microcapsules est mise en évidence par la libération des phages qu'elles contiennent. Deux modèles de plaie d'ulcère diabétique sont développés : le premier, sur peau humaine et dans une cellule de diffusion (cellule de Franz), pour mesurer le passage des phages à travers la peau humaine avec ou sans épiderme et le deuxième, sur peau de porc, pour évaluer l'efficacité de la formulation. Pour former les modèles, des portions de l'épiderme des peaux sont retirées à l'aide d'un poinçon à biopsie et d'un scalpel, des puits d'environ 0,5 mm de profondeur sont ainsi formés. Pour l'expérience de perméabilité, de l'élastase ou des biofilms de Pseudomonas aeruginosa sont ajoutés sur le modèle de plaie afin d'évaluer leurs effets sur la perméabilité de la peau aux phages. Pour l'expérience d'efficacité, les plaies formées sont infectées par une souche de Pseudomonas aeruginosa. Les pics de transmittance correspondant aux liaisons des atomes des groupes fonctionnels ester et amide du PEAU sont clairement identifiés sur les spectres FTIR. Les microcapsules de PEAU se dégradent dans le tampon lorsque soumises à une agitation mécanique et libèrent les phages qu'elles contiennent, mais aucune différence n'est mesurée en présence d'élastase comparée au groupe contrôle. La quantité de bactériophages libérés se maintient à un niveau important pendant les 72h d'incubation. Aucun passage de phages à travers les couches de la peau humaine n'est détecté lorsque celle-ci possède un épiderme sain. Cependant, un nombre important de phages parvient à traverser complètement le derme du modèle d'ulcère diabétique sur peau humaine à partir de 24-48h d'incubation. La formulation F10 est efficace contre le biofilm de Pseudomonas aeruginosa du modèle sur peau porcine en 72h d'incubation. La présence des groupes fonctionnels ester et amide dans le polymère PEAU a été confirmée, ils sont les cibles théoriques des protéases retrouvées sur les plaies d'ulcère diabétique, dont l'élastase. Cependant, nos résultats in vitro suggèrent que la présence d'élastase n'influence pas la cinétique de dégradation des microcapsules de PEAU. Sous l'influence de l'érosion à 32°C, la cinétique de dégradation des microcapsules leur permet de se dégrader graduellement pendant au moins trois jours et de libérer de manière prolongée et soutenue des phages qu'elles contiennent. La diffusion transdermique des phages dans la peau est considérablement augmentée lorsque qu'ils sont déposés sur le modèle d'ulcère diabétique (peau sans épiderme) : tous les phages en contact direct avec le derme ont la capacité de le traverser. De plus, la formulation F10 s'est montrée efficace pour détruire un biofilm de Pseudomonas aeruginosa à la surface du modèle d'ulcère diabétique. Les bactériophages semblent aussi limiter la diffusion transdermique des bactéries du biofilm. La cinétique de dégradation des microcapsules, la diffusion transdermique importante des phages dans le derme ainsi que leur bonne efficacité à détruire un biofilm sur un modèle de plaie d'ulcère diabétique, confirment que la formulation F10 est un traitement envisageable pour les infections d'ulcères diabétiques. Ces résultats in vitro encouragent la poursuite des travaux de caractérisation de la formulation F10 et la réalisation d'essais in vivo et cliniques dans l'objectif de la commercialiser. À termes la formulation F10 pourrait proposer une alternative viable aux antibiotiques pour traiter les infections d'ulcères diabétiques, en particulier lorsque celles-ci ne répondent plus aux traitements conventionnels, pour ainsi diminuer le risque de complications, d'amputation et améliorer la survie associée à ces pathologies.

Abstract

Diabetic pressure ulcers are common complications of diabetes and are often targeted by resistant and hard to treat bacterial infection. These infections are usually treated with antibiotics, but these treatments aren't always effective and about a quarter of them fail. Amputation, complications and death risks increase with treatment failure. Complex wound and biofilm morphology with the increase of multi-drug resistant bacterial strains circulating in the environment limits the overall efficacity of antibiotic therapy in the treatment of diabetic pressure ulcers. Increased resistance to antibiotics has led to the rediscovery of bacteriophages, or simply phages, (virus that only infect bacterial cells) in occidental medicine. Studies show the real potential of bacteriophages in destroying bacterial biofilms and to treat diabetic pressure ulcer infections. Phages could be an alternative to antibiotics to treat these kinds of infections. The use of a biodegradable polymeric matrix as a vehicle for phages is a conceivable strategy because it could allow an extended release of phages in the wound environment while protecting them from this harmful environment. This technology already showed great results with another type of chronic wound. The present study is about formulation F10 developed by Phagelux Canada, a formulation of 14 bacteriophages, free and encapsulated in biodegradable poly(ester amide urea) (PEAU) polymer microcapsules. These 14 bacteriophages are specific to a large specter of Staphylococcus aureus, Klebiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa strains. The main objective is to measure PEAU microcapsules' degradation kinetics and the capacity of F10 formulation to destroy biofilms deeply embedded in the skin. Secondary objectives are: (1) identify in the PEAU's chemical composition the ester and amide functional group implicated in its biodegradation, (2) measure PEAU microcapsules' degradation kinetic, (3) measure transdermal diffusion of F10's bacteriophages in a diabetic pressure ulcer wound model and (4) measure F10's efficacity to destroy a biofilm on a diabetic pressure ulcer wound model. PEAU functional group are identified with FTIR spectral analysis. Microcapsule biodegradation is performed in a buffer under mechanical agitation, with or without human neutrophil elastase (protease frequently present in diabetic pressure wound fluid) and incubated during 72h at 32°C. Microcapsules degradation is highlighted by the release of phages contained in them. Two diabetic pressure ulcer wound models are designed for this study: the first one, on human skin and in a Franz cell, to measure phage transdermal diffusion with or without the epidermis on the skin, and the second, on porcine skin, to measure F10's efficacity on a bacterial biofilm. In order to create these two models, portions of skin epidermis are removed with a biopsy punch and a scalpel, and wells of an approximative depth of 0,5mm are created. For the transdermal diffusion experiment, human neutrophil elastase or Pseudomonas aeruginosa biofilm are disposed on the wound depending on the conditions. For the efficacity study, the wound is infected with a Pseudomonas aeruginosa strain. Transmittance peaks corresponding to the chemical bonds of the amide and ester functional groups are clearly identified on the FTIR specter. PEAU microcapsules degrade and release encapsulated phages in the buffer when mechanically agitated, but there is no difference with or without human neutrophil elastase. Encapsulated phages are sustainably released during 72h. No phages completely cross the skin are detected in the receptor chamber of the Franz cell when the skin is healthy with an epidermis. But an important number of phages are detected in the receptor chamber when the skin doesn't have its epidermis on the wound model. F10 formulation show a good efficacity to destroy a Pseudomonas aeruginosa biofilm in the wound model in 72h. Ester and amide presence are confirmed in PEAU composition. They are theoretical targets of the pressure ulcer wound's proteases. However, our in vitro results show that human neutrophil elastase doesn't influence microcapsules degradation kinetics. Under the influence of erosion at 32°C, degradation kinetics of the microcapsules allows them to degrade during at least three days and sustainably release encapsulated bacteriophages. Phages' transdermal diffusion is considerably increased when they're put on the diabetic pressure ulcer wound models (skin without epidermis): they all have the potential to cross the dermis when in direct contact with the wound. F10 formulation shows a good efficacity against a Pseudomonas aeruginosa biofilm in our wound model. Furthermore, bacteriophages seem to limit bacteria's transdermal diffusion when they're on the wound. The microcapsules degradation kinetic, the important transdermal diffusion of phages across dermis and their good efficacy against a biofilm on the wound model, show the potential of the F10 formulation as a diabetic pressure ulcer infection treatment. These in vitro results support the pursuit of F10 characterization and future in vivo and clinical trials in order to commercialize this product. In the future, F10 formulation could improve diabetic pressure ulcer infection treatment, particularly when they don't respond to traditional antibiotics treatment, to reduce complications and amputations risks and to improve survival associated with these pathologies.