Développement de méthodes pour la quantification des particules pseudo-virales d'influenza

Le virus de la grippe est connu de par le monde pour les nombreux problèmes de santé publique qu'il cause annuellement (nombreux malades voire même morts dans les cas les plus invasifs). L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) est perpétuellement en alerte afin d'être prête à répondre à toute nouvelle épidémie virulente du virus. C'est la raison pour laquelle la vaccination contre le virus influenza est fortement conseillée afin de contrer au mieux l'étendue de l'infection dans la population, incluant principalement les personnes à risque. Les vaccins les plus couramment retrouvés sur le marché sont produits à partir d'oeufs embryonnés de poulet et sont composés de virus sous forme inactivée ou encore atténuée. Considérant qu'une dose vaccinale est en moyenne obtenue au départ d'un oeuf, cela pose des contraintes sévères au niveau de l'approvisionnement en cas de pandémies durant lesquelles un nombre très élevé de doses est requis. De plus, les longs délais d'approvisionnement (6 mois environ entre l'isolement de la souche virale et l'obtention du vaccin) ainsi que la possibilité d'un retour à la virulence soulèvent certaines problématiques à laquelle la communauté scientifique tente toujours de répondre. Une des alternatives proposées pour pallier aux lacunes des modes de production traditionnels réside dans l'utilisation de la culture cellulaire comme plateforme de production des virus. Ainsi, plusieurs candidats vaccins contre la grippe, produits dans les cellules CHO ou les cellules VERO, sont actuellement en cours d'essais cliniques. Récemment, une nouvelle génération de vaccins, à base de particules pseudo-virales (ou VLP), a été développée. Les principaux avantages de ces particules pseudo-virales résident dans le fait qu'elles sont dénuées de génome viral, tout en comportant les antigènes nécessaires à l'activation du système immunitaire, tels que l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Cependant, avant de pouvoir transposer la production de vaccins d'influenza à base de VLP dans un contexte industriel, un certain nombre de points critiques restent à développer et optimiser. Notamment, l'absence de génome est l'un des facteurs qui limite toujours l'établissement d'une méthode de quantification efficace pour ces particules. Ceci freine considérablement le développement des étapes de production et de purification, dont le suivi repose sur des méthodes v analytiques indirectes ou imprécises développées pour la quantification des protéines totales (SDS-PAGE, Western-Blot, quantification de protéines) ou pour celle de protéines spécifiques comme HA (SRID, test HA). Les objectifs de cette maîtrise recherche se sont donc articulés autour du procédé général des VLP, incluant plus spécifiquement l'étude de leur production en culture de cellules d'insectes et la mise au point d'une méthode de quantification permettant de soutenir le développement de cette nouvelle génération de candidats vaccins d'influenza. La production des VLP a été analysée avec un système d'expression composé de baculovirus recombinants (rBV) exprimant les protéines HA, NA et de matrice M1 dans les cellules d'insectes Sf9 et High Five. Suite à des étapes de purification, les particules générées en cellules Sf9 ont été analysées par SDS-PAGE, Western-Blot et microscopie électronique. Cette dernière analyse a permis de détecter une contamination importante (100 à 1000 fois supérieure à la quantité de VLP présentes) par les baculovirus utilisés lors de la production de ces VLP. Une étape de purification supplémentaire n'a cependant pas permis de séparer efficacement les VLP du reste des contaminants. Malgré plusieurs modifications dans les paramètres de production (e.g. choix de cellules hôtes, concentration cellulaire à infection, choix de MOI, rapports entre les BV) et dans les paramètres de purification (e.g. traitement des cultures), les niveaux d'expression et de pureté des VLP n'ont pas pu être augmentés de manière significative. Lors de ces essais, il s'est avéré que les constructions de baculovirus disponibles, principalement celle contenant HA, étaient instables dans le temps, entraînant des rendements de production très faibles et limitant par le fait même la poursuite des travaux d'optimisation de production des VLP. Parallèlement aux tests de production, le développement d'une méthode HPLC en phase inversée a été entrepris afin de permettre notamment la quantification de HA directement à même les surnageants de culture. En s'appuyant sur des travaux préliminaires réalisés sur des doses vaccinales par d'autres groupes de recherche, il a été possible de mettre en place une procédure adéquate permettant de détecter et quantifier de façon rapide et précise la concentration en HA présente dans des échantillons d'une culture de cellules HEK 293 infectées par un virus influenza de la souche A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Par le biais d'essais conduits avec des souches virales distinctes, il a également été démontré que la technique peut être utilisée pour analyser différents vi types de HA. Dans l'optique d'un criblage rapide et précis des différentes stratégies de production des VLP, cette technique se démarque comme étant une méthode de choix.

Abstract

Every year, influenza is responsible for numerous health problems world-wide mainly due to infections, which can cause death in the most serious cases. The World Health Organization (WHO) is continuously on alert to rapidly respond to the possible emergence of a pandemic viral strain. For this reason, vaccination against influenza is recommended to prevent the infection from spreading to the population, the most concerning cases being within high risk group populations. Vaccines frequently found on the market are obtained by viral replication in embryonated chicken eggs and contain inactivated or attenuated viruses. However, this production method presents limitations in terms of egg availability in the case of a pandemic as it is estimated that one vaccine dose is produced from one embryonated egg. Moreover, the process is long (about 6 months from the first strain isolation step to the final vaccine formulation) and the risk of virulence reactivation is another drawback that the scientific community is still trying to alleviate. The use of the cell culture technology as an expressing platform for virus production has been proposed to circumvent the limitations of the current production method. Vaccine candidates against flu that are produced in CHO or VERO cells are currently being evaluated in clinical trials. Recently, a new generation of vaccines, based on Virus Like Particles (VLP) have been developed. These particles present some advantages as their activity relies mainly on influenza's viral immunogenic activators, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), and are exempt of genetic material of the native virus. However, some critical points still require further development and optimization to get any influenza VLP-vaccine production into an industrial environment. The lack of genome is actually one of the parameters that restrain the establishment of an efficient quantification method for these particles. Consequently, the development of production and purification methods are considerably hindered as the analytical techniques are limited to indirect and imprecise methods developed for total proteins (SDS-PAGE, Western-Blot, total protein quantification) or some specific proteins such as HA (SRID, HA assay). The objectives of this research master are related to the VLP manufacturing process with a specific focus on the study of the production in insect cell culture and the set-up of a viii quantification method that is able to support the development of this new generation influenza sub-unit vaccine. Initially, VLP production has been studied with an expression system including recombinant baculoviruses (rBV) expressing the HA, NA, and M1 matrix proteins in Sf9 and High Five insect cells. The particles produced in Sf9 cells were analyzed, after purification, by SDS-PAGE, Western-Blot and electron microscopy. The latter analysis detected an important contamination (about 100 to 1000 times superior to the VLP contents) by the baculovirus used for VLP production. Although another step of purification has been added, it was impossible to efficiently separate the VLP from the surrounding contamination. Modifications of the production (e.g. host cell system, cell concentration at infection, choice of MOI, ratio between the baculoviruses) and the purification parameters (e.g. culture treatments previous to harvest) did not give any improvement in the expression and purity levels of VLP. Furthermore, during these trials, the baculovirus constructions available, especially the rBV-HA, showed some infectious instability over time, leading to low production yields. Consequently, the VLP production optimization workplan was significantly delayed. In addition to the production experiments, the development of a reversed-phase HPLC method was investigated in order to quantify the HA concentrations directly from the culture supernatant. A fast and accurate procedure, based on preliminary developments made by other research groups on vaccine doses, was found to detect and quantify the HA concentrations in the HEK 293 cell cultures infected by the A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) influenza virus. Experiments based on distinct viral strains demonstrated the potential of this method to analyze HA protein associated with different viral strains. Consequently, this method appears as a very effective and rapid screening technique for different VLP production strategies.