Optimisation de la culture 3D et de la différenciation de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des organoïdes pancréatiques compatibles avec les exigences pharmaceutiques

La demande croissante en thérapies régénératives à grande échelle accentue le besoin de méthodes de production robustes et compatibles avec les bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cultures cellulaires en 2D sont laborieuses, difficiles à transposer à grande échelle, et souvent dépendantes de composants d’origine animale, incompatibles avec un usage clinique. Ce travail visait à développer et à optimiser un protocole de culture en 3D pour la différenciation des hPSC en lignée pancréatique, en amorçant la suspension dès le stade 0, sans recours au Matrigel (matrice extracellulaire artificielle) ni à des supports synthétiques. Des travaux préliminaires ont été menés avec des cellules MIN6 (lignée cellulaire de souris dérivée de cellules β des îlots pancréatiques) dans un bioréacteur de 30 mL afin d’évaluer la viabilité, la taille des agrégats et les profils métaboliques. Des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) de type H1 et des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont ensuite été cultivées dans des plaques 6 puits à fond de culture non adhésif , sur mélangeur orbital, puis différenciées vers l’endoderme définitif (stade 1). Dans le but d'optimiser le protocole de différenciation, un plan d'expérience Taguchi L9 a permis d’évaluer les effets de l’activine A (50–150 ng/mL), du CHIR99021 (1,5–4,5 µM) et de la durée (3–5 jours) sur l'expression du facteur de transcription SOX17 servant de marqueur spécifique de l'endoderme définitif. Les résultats ont été analysés par cytométrie en flux et imagerie automatisée. Les meilleures conditions ont permis d’atteindre jusqu’à 97 % de cellules positives à SOX17 à partir de cellules iPSC en 3D traitées avec 150 ng/mL d’activine A et 4,5 µM de CHIR pendant 3 jours. L'utilisation de petits agrégats, plutôt que de cellules uniques, a amélioré la viabilité et l’homogénéité des structures formées, sans recourir à des matrices ou micro-puits spécialisés. Ce protocole constitue une plateforme évolutive et dépourvue de produits d’origine animale pour la différenciation précoce des hPSC vers la lignée pancréatique, compatible avec les exigences de production BPF.

Abstract

The growing demand for scalable regenerative therapies highlights the need for robust and GMP-compliant production methods for human pluripotent stem cells (hPSC). Traditional 2D culture systems are labor-intensive, difficult to scale, and often rely on animal-derived components that are incompatible with clinical applications. This study aimed to develop and optimize a 3D culture protocol for hPSC differentiation into the pancreatic lineage, starting at stage 0, using a Matrigel-free suspension approach in both static and dynamic systems. Preliminary work using MIN6 pancreatic beta cells in a 30 mL stirred-tank bioreactor characterized aggregation behavior, viability, and metabolic profiles. Human embryonic stem cells (H1) and induced pluripotent stem cell (iPSC) lines were then cultured in ultra-low attachment 6-well plates on orbital shakers and differentiated into definitive endoderm (stage 1). A Taguchi L9 experimental design evaluated the influence of activine A (50–150 ng/mL), CHIR99021 (1.5–4.5 µM), and duration (3–5 days) on SOX17 expression. Outcomes were assessed using flow cytometry and automated image analysis. Results demonstrated that iPSCs cultured in 3D and treated with 150 ng/mL activine A and 4.5 µM CHIR99021 for 3 days achieved up to 97% SOX17 positive cells. The use of small clusters, rather than single cells, significantly improved aggregate uniformity and viability. The protocol eliminated the need for synthetic scaffolds or AggreWell™ plates. This approach provides a scalable and xeno-free platform for early pancreatic differentiation of hPSCs, supporting future GMP-compliant manufacturing processes for cell therapy applications.