Optimisation des paramètres de photoblanchiment des biofluides afin de supprimer l'autofluorescence des échantillons et d'améliorer la qualité du signal de diffusion Raman

Depuis 2020, le LUMEDLAB s’intéresse à l’application de la spectroscopie Raman sur les biofluides tels que la salive, le sang et l’urine. La spectroscopie Raman permet d’obtenir de l’information sur la composition moléculaire d’un échantillon. Or, deux signaux sont en compétition lors de l’acquisition de spectres, la diffusion Raman et l’autofluorescence. Tous deux sont intrinsèques à l’échantillon imagé. La fluorescence, lorsque trop importante, apporte le problème de confusion des bandes Raman donnant l’information sur la composition moléculaire de l’échantillon. Ceci limite le rapport signal Raman sur signal de fond (SBR) ainsi que le rapport signal sur bruit (SNR) des spectres Raman. La solution proposée est la jonction d’une source photoblanchissante à un système de spectroscopie Raman déjà opérationnel afin de supprimer l’autofluorescence d’échantillons biofluides. Le photoblanchiment se base sur la dénaturation des fluorophores endogènes responsables de la fluorescence de l’échantillon biologique. La méthode est développée pour la détection de spectres de la salive humaine. Des tests sont faits sur des échantillons inertes ayant une forte réponse Raman et en fluorescence, tels que des graines de sésame, de la poudre de collagène pur et un modèle de salive afin d’optimiser les paramètres expérimentaux du protocole. Les tests finaux sur la salive humaine démontrent que la méthode valide l’objectif du projet avec environ en moyenne 40% du niveau initial de fluorescence supprimé pour les échantillons de salive séchée à l’air ambiant et 30% pour celle liquide. La salive sèche obtient un gain moyen de SBR de la bande Raman 1003 cm-1 de 1% et celle liquide, un gain moyen de 0,1%, ce qui représente une augmentation moyenne d’environ 85% et 10% respectivement. La salive sèche, en moyenne, obtient un gain d’environ 0,005 de SNR par rapport à sa valeur initiale, une amélioration d’environ 33% et un gain de 0,003, soit une amélioration de 17% pour celle liquide. Or, la moitié des échantillons de salive sèche ainsi que quelques gouttes de salive liquide ont subi un regain de fluorescence. Ces spectres n’ont pas eu des améliorations aussi marquées, mais ils ont quand même obtenu une amélioration de qualité de signal. L’analyse de ces résultats a permis de déterminer que la jonction photoblanchissante du montage expérimental n’est en fait pas la cause de ces améliorations, mais le laser Raman lors de l’acquisition des spectres. Ainsi, la recommandation principale de ce mémoire est de poursuivre cette étude en omettant l’ajout de la source photoblanchissante blanche et de simplement exposer l’échantillon au laser Raman avant l’acquisition jusqu’à stabilisation de la suppression du signal de fluorescence, qui correspond à 30s d’exposition selon les expériences faites sur des échantillons de salive sèche.

Abstract

Since 2020, the LUMEDLAB has been interested in the application of Raman spectroscopy on biofluids such as saliva, blood and urine. Raman spectroscopy provides information on the molecular composition of a sample. However, two signals compete during spectral acquisition: Raman scattering and autofluorescence. Both are intrinsic to the imaged sample. When fluorescence is too high, it causes the problem of confusing the Raman bands which provide information on the molecular composition of the sample. This limits the Raman signal to background signal ratio (SBR) as well as the signal-to-noise ratio (SNR) of the Raman spectra. The solution proposed by this Master thesis is the add-on of a photobleaching source to an already operational Raman spectroscopy system to suppress the autofluorescence of biological samples. Photobleaching is based on the denaturation of endogenous fluorophores responsible for the fluorescence of the biological sample. The method will be developed for the detection of spectra in human saliva, but it can be generalized to other biological media such as tissues. Tests performed on inert samples with a strong Raman and fluorescence response, such as sesame seeds, pure collagen powder and a saliva model, optimize experimental parameters of the protocol. Final tests on human saliva showed that the method validates the project objective with approximately on average 40% of the initial level of fluorescence suppressed for air-dried saliva samples and 30% for liquid saliva samples. Additionally, dry saliva achieves an average SBR gain at the 1003 cm-1 Raman band SBR of 1% and liquid saliva achieves an average SBR gain of 0,1%, representing an average increase of approximately 85% and 10% respectively relatively to their initial values. On average, air-dried saliva samples gain about 0,005 in SNR of their Raman spectra compared to their initial value, a 33% increase and liquid saliva samples gain about 0,003 in SNR, a 17% increase. However, half of the dry saliva samples as well as a few drops of liquid saliva experienced fluorescence recovery. These spectra did not achieve as significant improvements, they still however achieved signal quality improvements in both SBR and SNR. Indeed, the analysis of these results shows that the photobleaching extension of the experimental setup is in fact not the cause of these improvements but the Raman laser during the acquisition of the spectra. Thus, the main recommendation of this thesis is to continue this study by omitting the addition of the photobleaching source and simply exposing the sample to the Raman laser before spectral acquisition until the suppression of the fluorescence signal stabilizes, which corresponds to 30s of exposure according to experiments carried out on dry saliva samples.