Étude métabolique des cellules myéloïdes suppressives dans le contexte du phénomène d'immunosuppression

Le caractère invasif et les effets secondaires associés aux approches thérapeutiques anticancéreuses conventionnelles ont donné naissance à une nouvelle stratégie, appelée l'immunothérapie, qui consiste à rétablir la capacité du système immunitaire à reconnaître la tumeur et inhiber sa croissance. Toutefois, ce processus d'immunosurveillance devient rapidement dysfonctionnel dû à la maturation d'une population de cellules myéloïdes suppressives, les MDSC, et à son recrutement dans la rate, les organes lymphoïdes, le sang et la tumeur des personnes présentant un cancer. Ces cellules ont la particularité d'exprimer deux enzymes qui métabolisent l'acide aminé L-arginine (L-arg), soit la synthétase inductible d'oxyde nitrique (iNOS) et l'arginase 1 (ARG1). La faible concentration du L-arg dans le sang et l'accumulation des dérivés de l'oxyde nitrique (NO) inhibent les fonctions immunomodulatoires des cellules effectrices du système immunitaire ainsi que leur prolifération, et induisent leur mort. Jusqu'à présent, la majorité des approches thérapeutiques anti-MDSC cible des marqueurs de surface, des enzymes ou des voies signalisation spécifiques impliquées dans la maturation des MDSC ou au niveau du métabolisme du L-arg. Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse sont basés sur l'hypothèse que le phénomène d'immunosuppression est énergivore. En fait, la maturation des MDSC à partir de précurseurs myéloïdes implique plusieurs voies et facteurs de signalisation dont l'activation est directement ou indirectement dépendante de l'énergie. Nous avons également supposé que la compréhension des événements métaboliques ayant lieu durant la maturation des MDSC, le métabolisme du L-arg et l'interaction entre le NO et les cellules effectrices du système immunitaire, peut mener à l'identification de nouvelles cibles de l'immunothérapie. Dans un premier temps, la maturation des MDSC a été simulée en exposant des cellules de la moelle osseuse aux GM-CSF et IL-6. Cette combinaison de cytokines génère une population de MDSC similaire à celle qui infiltre la tumeur. Les résultats de ces travaux ont fait l'objet d'un premier article soumis à "Cancer Research". Il y est montré que la maturation des MDSC et l'activation subséquente des enzymes iNOS et ARG1 sont accompagnées par la stimulation du métabolisme central du carbone. Particulièrement, le glucose a été majoritairement métabolisé via la glycolyse avec une moindre quantité acheminée vers la voie des pentoses phosphates. Cependant, les MDSC diminuent leur respiration durant la maturation pour favoriser le mode anaérobique qui résulte en la production de lactate. Le faible rendement énergétique du métabolisme glycolytique est compensé par la stimulation de la glutaminolyse qui, à son tour, active la production de l'énergie par le cycle de l'urée. La L-glutamine (L-gln) s'est avérée également une source importante de pyruvate. En fait, l'enzyme malique convertit le malate en pyruvate tout en produisant la NADPH. De même, la régulation à la hausse du cycle de l'urée assure la synthèse endogène du L-arg. Ensuite, afin de déterminer les besoins nutritionnels et énergétiques associés au métabolisme du L-arg, une lignée immortalisée de MDSC murines, MSC-1, a été utilisée. La ligne de base de l'énergétique des cellules MCS-1 a été tout d'abord établie pour servir de référence pour des études ultérieures. Deux états stationnaires correspondant aux phases exponentielle et stationnaire sont identifiés. Les cellules MSC-1 étaient actives durant la phase exponentielle, alors qu'une détérioration globale du métabolisme est notée dans la phase stationnaire. Les résultats de ces travaux ont été publiés dans "Journal of Biotechnology" en 2011. Dans un troisième papier soumis à "Cancer Immunology and Immunotherapy" en 2011, nous avons montré que l'activité de iNOS et la machinerie immunosuppressive qui y est associée requièrent la stimulation du métabolisme central du carbone, contrairement à l'ARG1 dont l'activité est indépendante de l'état métabolique des cellules. De plus, la glutaminolyse joue un rôle important dans le phénomène d'immunosuppression, particulièrement dans celui relié à l'enzyme iNOS, en assurant une forte activité du cycle de l'urée et subséquemment la production d'énergie et le recyclage du L-arg. Cependant, le glucose ne compense pas la régulation à la baisse de ces processus en absence de la L-gln. Ainsi, le contrôle des flux à travers la glutaminolyse, en inhibant le transporteur de la L-gln ou l'activité enzymatique de la glutaminase, pourrait constituer une cible de valeur pour le traitement des pathologies induites par le NO. Enfin, pour caractériser l'effet des MDSC sur l'énergétique des cellules effectrices du système immunitaire, nous avons cultivé les cellules Jurkat, considérées comme modèle de cellules immunitaires stimulées (les cellules T), en présence d'un nouveau donneur de NO (AT38) conçu pour l'inhibition de la progression de la tumeur et l'accumulation des MDSC. Ces travaux, soumis à "Immunology and Cell Biology" en 2011, ont montré que ce donneur : i) inhibe irréversiblement la respiration cellulaire, ii) inhibe la prolifération des cellules, comme l'indiquait la diminution de la concentration en pyrimidines, iii) induit la mort des cellules Jurkat par apoptose jusqu'à une concentration "seuil" en glucose au-delà de laquelle les cellules mourraient par nécrose. Nous avons également démontré que le nitrite exerce les mêmes effets sur les cellules Jurkat alors que le nitrate a un potentiel immunsouppressif dépendant de la concentration et du temps. Pour atténuer les effets nocifs des donneurs de NO sur le système immunitaire, une stratégie consistant à bloquer l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial par la cyclosporine A est proposée. Cette approche permet de diminuer la capacité du NO à inhiber la prolifération des cellules Jurkat et à induire leur mort. Nous avons donc réussi, lors de ces travaux, à caractériser le comportement nutritionnel des MDSC et particulièrement de mettre en évidence les événements métaboliques ayant lieu durant leur maturation. En conclusion, la régulation croisée entre le métabolisme du L-arg et le métabolisme central du carbone observée tant chez les MDSC que chez les cellules Jurkat a permis de suggérer le contrôle de l'état énergétique des cellules comme cible prometteuse pour l'immunothérapie.

Abstract

The invasiveness and side effects of conventional anticancer therapeutic approaches gave rise to a new strategy, called immunotherapy, which consists on the recovery of the immune system ability to recognize tumours and inhibit their outgrowth. However, this immunosurveillance process rapidly becomes dysfunctional due to the maturation of a myeloid-derived suppressor cell (MDSC) population from bone marrow precursors and its recruitment in spleen, lymphoid organs, blood and tumour of cancer-bearing hosts. MDSCs have the particularity of expressing two enzymes that metabolize the amino acid L-arginine (L-arg): inducible nitric oxide synthase (iNOS) and arginase 1 (ARG1). The sparse availability of L-arg and the accumulation of nitric oxide (NO) derivatives then inhibit immunomodulatory functions of immune effector cells as well as their proliferation, and induce their death. Up to now, the majority of anti-MDSC therapeutic approaches are targeting surface markers, enzymes or specific signalling pathways implicated in MDSC maturation or L-arg metabolism. The study presented herein is based on the hypothesis that the immunosuppression phenomenon is an energetically-costly process. In fact, the maturation of bone marrow precursors into MDSCs implies several signalling pathways and factors whose activation is directly or indirectly energy-dependent. We also propose that the comprehension of the metabolic events occurring during MDSC maturation, L-arg metabolism and interactions between NO and immune effector cells may lead to the identification of new targets for immunotherapy. First, MDSC maturation was simulated by exposing bone marrow cells to GM-CSF and IL-6. This cytokine combination leads to the generation of a cell population similar to tumour-infiltrating MDSCs. Results of this work were the subject of a first article submitted to "Cancer Research". It was shown that MDSC maturation and the consequent activation of iNOS and ARG1 were accompanied by the enhancement of central carbon metabolism. Particularly, glucose was mostly metabolized through glycolysis with sparse quantity processed through the pentose phosphate pathway. However, MDSCs showed to down-regulate their respiration during the maturation process favouring an anaerobic metabolism that results in lactate production. The low energetic yield of glycolytic metabolism was compensated by the energy derived from the urea cycle whose activity was enhanced by the stimulation of glutaminolysis. Up-regulation of urea cycle activity ensures the endogenous synthesis of L-arg and so, the maintenance of MDSC immunosuppressive activity. Moreover, it turned out that L-glutamine (L-gln) is an important source of pyruvate. In fact, the malic enzyme converts malate into pyruvate and jointly ensures NADPH supply. Thereafter, in order to identify the specific nutritional and energetic requirements that are related to L-arg metabolism, we used an immortalized cell line (MSC-1) derived from mouse MDSCs. The baseline of MSC-1 cell bioenergetic was first established to serve as a reference in subsequent study focussing on iNOS and/or ARG1 inhibition. Two steady-states corresponding to the exponential and stationary phases were identified. MSC-1 cells were active during the exponential phase, whereas a deterioration of global metabolic activity was noticed in the entry of the stationary phase. Results of this work were published in "Journal of Biotechnology" in 2011. In a third paper submitted to "Cancer Immunology and Immunotherapy" in 2011, we have shown that iNOS-related immunosuppressive machinery requires the stimulation of central carbon metabolism whereas ARG1 activity showed to be independent of cell metabolic state. Moreover, glutaminolysis revealed playing an important role in the immunosuppression phenomenon particularly that related to iNOS, by ensuring an enhanced urea cycle activity which consequently produces energy and activates L-arg recycling pathway. However, glucose uptake did not compensate for the down-regulation of these processes in the absence of L-gln. Therefore, controlling fluxes through glutaminolysis, by inhibiting L-gln transporter or the enzymatic activity of glutaminase, may be a promising alternative to treat NO-induced pathologies. Finally, to characterize MDSC effects on the energetic states of immune effector cells, we cultured Jurkat cells, considered as a model system of immune challenged cells (T cells), in the presence of a new NO donor (AT38) developed to inhibit tumour progression and MDSC accumulation. This work, submitted to "Immunology and Cell Biology" in 2011, showed that this donor: i) irreversibly inhibits cell respiration, ii) inhibits cell proliferation, as revealed by the decrease of pyrimidines' concentrations, iii) induces apoptosis until a glucose threshold concentration, above which cell death process was switched into necrosis. We also demonstrated that nitrite triggers similar effects on Jurkat cells, whereas nitrate has a time and concentration –dependent immunosuppressive potential. To attenuate harmful effects of NO on immune system, a strategy consisting on blocking the opening of the mitochondrial permeability transition pore by cyclosporine A was proposed. This approach has diminished NO ability to inhibit Jurkat cell proliferation and induce cell death. We have thus characterized MDSC nutritional behaviour and particularly highlighted the metabolic events occurring during their maturation. In conclusion, cross-regulation between L-arg metabolism and the central carbon metabolism observed either in MDSCs or Jurkat cells is suggesting the control of cell energetic status as a promising target for immunotherapy.