Development of an Electrochemical Immunosensor for Detection of Staphylococcus Aureus in Prosthetic Joint Infection

L'infection des prothèses articulaires est la principale cause de défaillance des implants, ce qui représente un fardeau considérable pour les patients et le système de santé. Il est essentiel de diagnostiquer l'IPP à un stade précoce, car un diagnostic tardif entraîne une infection plus étendue et des dommages à l'implant. L'identification de la cause microbienne de l'IPJ est cruciale pour déterminer la décision appropriée en matière de traitement antimicrobien. S. aureus est considéré comme l'agent pathogène le plus fréquent, contribuant à 19-29% des IPJ. La détection des infections bactériennes repose actuellement sur des méthodes laborieuses, coûteuses, chronophages et exigeantes en termes de compétences, ce qui rend le diagnostic difficile pour les systèmes de soins de santé et les individus. Les biocapteurs électrochimiques constituent une méthode alternative permettant d'accélérer les résultats de la détection en quelques minutes. Il a été établi qu'ils sont plus rapides, très sensibles, fiables et faciles à miniaturiser, ce qui en fait une solution attrayante pour la détection en temps réel des agents pathogènes. Dans cette thèse, un immunocapteur ultra-sensible sans étiquette a été développé pour détecter S. aureus par la mesure d'une métalloprotéase extracellulaire de S. aureus, l'aureolysine, pour la première fois. L'immunocapteur a été fabriqué à partir d'une électrode en or sérigraphiée (SPGE) modifiée par des nanopointes d'or électrodéposées. En raison de leur conductivité élevée et de leur grande surface, les nanopointes d'or ont été utilisées pour augmenter le transfert d'électrons. Un auto-assemblage d'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) a été ancré à la surface de l'électrode en utilisant la chimie or-soufre. Des anticorps anti-auréolysine ont été fixés de manière covalente aux MUA sur des nanopointes d'Au, via la chimie de couplage N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide chlorhydrate (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS).

Abstract

Prosthetic Joint Infection (PJI) is the leading cause of implant failure, causing considerable burden on patients and the healthcare system. It is crucial to diagnose PJI in early stages, because a delayed diagnosis causes more extensive infection and damage to the implant. Identifying the microbial cause of PJI is crucial to determine the appropriate decision for antimicrobial treatment. Staphylococcus aureus (S. aureus) is considered the most frequent pathogens contributing to 19–29% of PJIs. The detection of bacterial infections currently relies on laborious, costly, time-consuming, and skill-intensive methods, making diagnosis challenging for health care system and individuals. Electrochemical biosensors are an alternative method to expedite detection results in order of minutes. They have been established to be more rapid, highly sensitive, reliable, and easy to miniaturize, thus making them an attractive solution for real-time pathogen detection. In this thesis, an ultra-sensitive label-free immunosensor was developed to detect S. aureus through the measurement of an extracellular metalloprotease of S. aureus, aureolysin, for the first time. The immunosensor was fabricated based on a screen-printed gold electrode (SPGE) which was modified by electrodeposited gold nanospikes. Due to high conductivity and large surface area, gold nanospikes were employed to increase electron transfer. A self assembly of 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) were anchored on the surface of the electrode using gold-sulfur chemistry. Anti-aureolysin antibodies were covalently attached to MUA on Au nanospikes, via N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) coupling chemistry. Bovine serum albumin (BSA) was adsorbed on SPGE’s surface to block nonspecific interaction. The scanning electron microscopy was used to confirm electrochemical deposition of nanospikes, and cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) techniques were employed to characterize the sensor through the fabrication process. The presence of aureolysin and S. aureus was detected by analyzing the change in peak current following antigen-antibody complex formation. The measurement of aureolysin in buffer solution was carried out using DPV in a redox solution of [Fe(CN)6]3-/4-. Subsequently, the measurement of S. aureus in culture medium was performed using the same technique and solution.