The Role of Biomaterials in Synovial Joint Inflammation and Chondrogenesis Towards the Development of a Novel Post-Surgical Articular Cartilage Repair Therapy

La réparation du cartilage a été depuis de nombreuses années une priorité de la recherche orthopédique, car les lésions du cartilage conduisent régulièrement au développement de maladies arthritiques des articulations, qui touchent environ 19,3% de la population canadienne. Avec l'augmentation constante du nombre de Canadiens diagnostiqués avec un type d'arthrites, il y a un besoin important pour un traitement efficace qui permette de contrôler les douleurs articulaires et de retarder de ce fait le remplacement total de l'articulation, qui est une procédure chirurgicale coûteuse. La stimulation de la moelle osseuse est une des techniques chirurgicales communément utilisées pour induire la régénération du cartilage, cependant celle-ci ne conduit pas toujours à la création d'un cartilage hyalin, mais plutôt à la création d'un fibrocartilage qui n'a pas les propriétés mécaniques nécessaires pour subvenir à la fonction motrice du genou sur le long terme. Des implants à base de chitosane utilisés en combinaison avec une stimulation de la moelle osseuse peuvent améliorer significativement la qualité de la réparation en recrutant et en activant des cellules immunitaires au site de réparation dans le tissu cartilagineux. Par ailleurs, des études cliniques ont montré que les dispositifs médicaux à base de chitosane, tel que le BST-CarGel®, étaient en mesure d'induire une réparation plus hyaline que la technique chirurgicale de stimulation de la moelle osseuse seule, cependant le résultat reste variable et les raisons de cette variabilité ne sont toujours pas comprises. La destruction du cartilage articulaire a été la marque principale des maladies arthritiques depuis des décennies, cependant des études récentes ont montré que l'arthrose et l'arthrite rhumatoïde touchent aussi les autres tissus conjonctifs de l'articulation, conduisant ainsi à définir ces maladies comme des maladies de l'articulation entière. L'inflammation de la membrane synoviale a été notamment identifiée comme un facteur important dans les pathologies des maladies arthritiques, mais son rôle dans le processus de réparation du cartilage n´a pas encore été identifié. Dans des études récentes, des oligomères de chitosane ont été identifiés comme ayant un effet anti-inflammatoire sur les macrophages. Ces cellules immunitaires sont présentes sur le site de la réparation, mais elles résident aussi dans la membrane synoviale avec les cellules synoviales de type fibroblastique qui fournissent des cytokines et de l'acide hyaluronique au liquide synovial. Le liquide synovial fournit des éléments nutritifs aux tissus non vascularisés de l´articulation et démontre des propriétés chondro-protectrices qui favorisent un mouvement sans friction de l'articulation grâce à sa viscosité. L'objet principal de ce travail doctoral a été de rechercher les facteurs qui régulent la production d'acide hyaluronique (HA) par les cellules synoviales et de développer une solution injectable innovante à base d'oligomères de chitosane capable de maintenir le niveau d'HA dans le liquide synovial tout en créant un macro environnement intra articulaire favorable à la régénération hyaline du cartilage. Ainsi, cette thèse doctorale présente trois études principales : Chapitre 1 – Pour mieux comprendre les mécanismes de production de HA, des cultures in vitro de cellules synoviales de type fibroblaste (FLS) humaines ont été stimulées par des cytokines et des facteurs de croissance couramment trouvés dans les articulations inflammées. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle les cytokines, qui sont connues pour augmenter la production de HA dans les FLS, pourraient aussi réguler l´activité de l'enzyme UDP-glucose déshydrogénase (UDPGD), une enzyme clé dans la synthèse du HA. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode de coloration enzymatique in situ pour détecter l´activité d´UDPGD dans les cultures primaires de FLS, qui a été adaptée de protocoles de coloration pour les tissus synoviaux. Les résultats montrent que la production de HA était déclenchée dans les FLS par des cytokines inflammatoires, morphogénétiques et anaboliques et était qualitativement non corrélée avec l'activité d´UDPGD. L´activité d´UDPGD était plutôt régulée par un contact cellulaire qui pourrait expliquer comment le manque de contact cellulaire des synoviocytes pendant l´inflammation du genou conduit à un manque d´activité d´UDPGD sans affecter les taux de HA. Chapitre 2 (article soumis) – L'histologie de tissus méniscaux non fixés a été utilisée pour étudier la microarchitecture de la matrice extracellulaire méniscale et pour caractériser les changements structuraux survenant dans le ménisque à la suite d'interventions chirurgicales sur le genou. Dans le ménisque, des fibres en forme de bobines, que nous surnommons « inter-tie coils », ont été identifiées comme étant des sous-structures des fibres circonférentielles de collagène, et disparaissent lors de la fixation à base de formol du tissue méniscal. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle les « inter-tie coils » sont modifiées à la suite d'une intervention chirurgicale sur le genou et dans les ménisques fibrillés. Les résultats ont montré que l´épaisseur de ces fibres était de temps en temps modifiée suivant des dommages aux ménisques et ou des chirurgies du genou impliquant des techniques de stimulation de moelle osseuse, ce qui est compatible avec la notion que l'articulation se comporte comme un organe complet. Chapitre 3 – Finalement, un modèle in vivo de lésion chronique du cartilage développé chez le lapin a été utilisé pour étudier la réponse de la membrane synoviale à la technique de stimulation de la moelle osseuse dans la trochlée du fémur pour évaluer l'innocuité et l'efficacité de matériaux à base de chitosane injectés de manière intra articulaire comme une nouvelle thérapie anti-inflammatoire post chirurgicale visant à favoriser la réparation du cartilage. Dans cette étude pilote, les hypothèses testées étaient que des injections hebdomadaires de différentes formulations de chitosane administrées post opération allaient préserver le niveau de HA dans le liquide synovial et réduire le niveau d´inflammation de la membrane synoviale tout en facilitant la réparation du cartilage. Cette étude est la première à notre connaissance à étudier les effets de la stimulation de la moelle osseuse et d'injections intra articulaires de chitosanes sur le cartilage, le liquide synovial et la membrane synoviale. Après un délai de trois semaines post stimulation de la moelle osseuse, les défauts microperforés étaient encore en cours de réparation du tissu. Trois lapins ont été utilisés pour caractériser le modèle choisi, soit un genou pour connaitre l'état de la lésion chronique à 1 semaine après la stimulation de la moelle osseuse par micro-perforation (équivalent à 35 jours), et le genou contre-latéral laissé intact comme comparatif. Les résultats ont montré que les défauts chroniques à 28 jours ont peu ou pas d'effet sur l'effusion du genou et sur le niveau normal de HA dans le liquide synovial, alors qu'à 35 jours, les niveaux de HA ont augmenté significativement par rapport à ceux des genoux intacts. Les injections intra articulaires de certaines formulations de chitosane ont maintenues des niveaux élevés de HA jusqu'à trois semaines après stimulation et ont démontré une capacité à recruter des cellules inflammatoires dans le liquide synovial au-delà du niveau observé dans le genou intact. La membrane synoviale a été très réactive à la stimulation de la moelle osseuse à une semaine et à trois semaines post opération. La membrane a subi un changement étonnant d'un tissu adipeux vers un tissu fibreux aréolaire, avec une hyperplasie significative, une infiltration importante de macrophages RAM-11+ et AM-3K+ et une augmentation de la vascularisation indépendamment des conditions d'injection intra articulaire. Cette étude a contribué à approfondir notre connaissance du microenvironnement synovial après une intervention chirurgicale et a permis de mettre en lumière la réponse complexe de la membrane synoviale après la stimulation de la moelle osseuse. En résumé, cette thèse doctorale montre que le liquide synovial, la membrane synoviale et le ménisque sont changés par l'inflammation de l'articulation et pendant le processus de réparation. Comme il a été montré dans les pathologies et les blessures de l'articulation du genou, les résultats de cette thèse montrent qu'il est important de considérer le genou comme un organe complet afin de comprendre les mécanismes de réparation. Par ailleurs, les travaux de cette thèse suggèrent que des formulations spécifiques à base de chitosane, connues pour induire la production de cytokines anti-inflammatoires chez les macrophages, peuvent potentiellement servir dans la conception d'une thérapie post opératoire sous forme d'injection intra articulaire.

Abstract

Cartilage repair therapies have been a focus of orthopaedic research for the past decades, since cartilage lesions lead to arthritic joint diseases, which burden approximately 19.3% of the Canadian population. As the number of Canadians diagnosed with arthritic disease is expected to rise, there is an urgent need for effective alternative treatment to manage joint pain and to delay the costly undergoing of total joint replacement. Bone marrow stimulation is one of most common surgical procedure performed to induce cartilage regeneration, however repair often leads to fibrocartilage instead of hyaline cartilage, which cannot support the mechanical function of the knee long-term. When combined with bone marrow stimulation, chitosan-based implants can be used to improve the quality of tissue repair by recruiting and activating immune cells in the repairing cartilage tissue. Clinical studies have shown that chitosan-based medical devices, such as BST-CarGel®, provide a more “hyaline-like” repair in comparison to the surgical technique alone, however outcomes remain variable and the root causes of failed repair are not yet understood. The destruction of articular cartilage has been the hallmark of arthritic diseases for decades, however recent studies have shown that osteoarthritis and rheumatoid arthritis pathologies also affect the other connective tissues of the joint, making it a whole joint disease. The synovial membrane inflammation has notably been identified as an important factor in the pathology of arthritic diseases, but its role in the articular cartilage repair process has not yet been defined. In recent studies, chitosan oligomers were reported to have anti-inflammatory effects on macrophages. These immune cells are recruited to the repair site but they are also present in the synovial membrane along with fibroblast-like synoviocytes that both supplement the synovial fluid with cytokines and hyaluronic acid (HA). The synovial fluid is responsible for providing nutrients to the avascular connectives tissues of the joint and has chondro-protective properties supporting the frictionless motion of the joint thanks to its viscous properties. Thus, the main purpose of this doctoral project was to investigate factors that regulate synovial membrane HA production and to develop a novel injectable chitosan-based oligomer therapy able to maintain HA levels of the synovial fluid, while creating an intra-articular macro-environment in the whole joint favorable to hyaline cartilage regeneration. This doctoral thesis presents three main studies. Chapter 1 – To further our understanding on HA production, in vitro cultures of primary human synoviocyte-like fibroblasts (FLS) were stimulated by cytokines and growth factors commonly found in the joint cavity during inflammation. We tested the hypothesis that cytokines known to increase FLS HA release would also upregulate the enzymatic activity in FLS of UDP-glucose dehydrogenase (UDPGD), a key enzyme in HA synthesis. In this study, we developed a novel in situ enzyme staining method to detect UDPGD activity in primary FLS monolayer and aggregate cultures, adapted from a staining protocol in synovial tissue. Results showed that HA production was induced in FLS by inflammatory, morphogenetic and anabolic cytokines and was qualitatively unrelated to UDPGD activity. UDPGD activity was up-regulated by cell-cell contact, which could explain how loss of synoviocyte cell-cell contact during knee inflammation leads to depressed UDPGD activity in knees with higher synovial fluid HA levels. Chapter 2 (Submitted article) – Histology of unfixed meniscal tissue was used to study microarchitecture of the meniscal extra-cellular matrix and to characterize structural changes occurring within the meniscus following surgical interventions. In the meniscus, inter-tie coils were identified as substructures of circumferential collagen fibers, that are lost with formalin fixation. We tested the hypothesis that inter-tie coils thickness is altered following surgical interventions on the knee and in fibrillated menisci. Results showed that inter-tie coil thickness was sporadically altered following meniscal damage or knee surgery involving bone marrow stimulation, which is consistent with the notion that the knee joint responds to inflammation as one whole organ. Chapter 3 – Finally, a chronic cartilage lesion in vivo rabbit model was used to investigate the synovial membrane's response to bone marrow stimulation in the femoral trochlea and to evaluate the safety and efficacy of intra-articular (IA) injected chitosan materials as a potential novel anti-inflammatory post-surgical articular cartilage repair therapy. In this pilot study, the hypotheses tested were that weekly injections of chitosan formulations administered post-operatively would preserve synovial fluid HA levels and high molecular weight, and reduce synovial membrane inflammation score, all the while improving cartilage repair. This study is the first to our knowledge to collectively study the effect of bone marrow stimulation and IA-injected chitosan formulations on the cartilage, the synovial fluid and the synovial membrane. At 3 weeks post-bone marrow stimulation, microdrilled cartilage defects were at the stage of ongoing repair. Three rabbits were used to characterize the model, namely one knee with a chronic defect at 1 week of being treated with bone marrow stimulation by microdrilling, compared to the contralateral intact knee. Results showed that the 28-days chronic defect has little effect on knee effusion or HA levels in the synovial fluid, while at 1-week following bone marrow stimulation HA levels were significantly increased compared to the intact knees. IA-injections of certain chitosan structures maintained high HA levels at 3-weeks post-operative and were found to induce significant recruitment of inflammatory cells into the synovial fluid, above the levels seen in intact knee joints. The synovial membrane was highly responsive to bone marrow stimulation at 1 week and 3 weeks post-operation. The synovial membrane underwent a striking change from an adipose type to a more fibrous areolar type, with significant hyperplasia, increased macrophage infiltration and increased vascularity irrespectively of IA-injected condition. This study contributed to furthering our understanding of synovial microenvironment following surgical interventions and to reveal the complex response of the synovial membrane to BMS. All together, this doctoral thesis shows that the synovial fluid, the synovial membrane and the meniscus are altered in the cases of joint inflammation and in the process of cartilage repair. As it has been shown in pathology and injury, the findings of this doctoral thesis support the notion that the knee should be treated as a whole organ in case of repair. And finally, this work suggests that specific chitosan formulations, known to induce a higher release of anti-inflammatory cytokines in macrophages, could potentially serve in the design of a post-surgical therapeutic IA-injection.