Utilisation de l'acide poly (propyl acrylique) pour augmenter l'efficacité in vitro des nanoparticules à base de chitosane et ARN messager

L'ARNm a un fort potentiel en thérapie génique pour des applications de vaccination contre le cancer, le remplacement de protéine défectueuse, l'édition du génome et la reprogrammation de cellules souches. Néanmoins, la livraison de l'ARNm représente un défi scientifique et technologique de taille, car elle est limitée par plusieurs barrières telles qu'une dégradation rapide dans le plasma, la difficulté à pénétrer dans la cellule et une séquestration/dégradation au niveau des endosomes. Cette barrière endosomale demeure à ce jour l'une des plus difficiles à franchir. Pour surmonter certains de ces obstacles, plusieurs véhicules de livraison ont été développés à base de virus, lipides, polymères. Le chitosane (CS), un polymère naturel cationique, peut lier et condenser les acides nucléiques pour former des nanoparticules, ce qui les protège et augmente leur internalisation cellulaire. Toutefois, la capacité des nanoparticules à base de CS à surmonter la séquestration endosomale demeure limitée et pourrait être augmentée par l'utilisation d'agents endosomolytiques. L'objectif principal de ce projet était d'incorporer l'acide poly(propyle acrylique)(PPAA), un agent endosomolytique, à des nanoparticules de CS/ARNm dans le but d'accroître leur efficacité. Le PPAA a été incorporé à différentes concentrations dans des nanoparticules binaires de CS/ARNm. Les propriétés physico-chimiques (taille, PdI, potentiel-zeta, pH) et l'efficacité de transfection in vitro des nouvelles formulations ternaires (CS/ARNm/PPAA) ont été caractérisées. De plus, ces formulations ont été formées avec/sans tampon et en présence/absence de tréhalose, une molécule utilisée pour la lyophilisation des nanoparticules. En présence de tréhalose et tampon, le PPAA était principalement incorporé dans les nanoparticules qui avaient une taille d'environ 170 nm et une charge de surface de 12 mV. Une augmentation de l'efficacité de transfection (~10 fois) fut observée pour une concentration intermédiaire de PPAA en présence de tampon et tréhalose. Par la suite, l'efficacité a été augmentée davantage en retirant le tréhalose et en augmentant la concentration de mélange de l'ARNm. Cette nouvelle formulation a atteint une efficacité comparable à ~86% du contrôle lipidique LipofectamineTM et ce sans aucun signe de toxicité. Ces résultats suggèrent que la présence de PPAA dans les nanoparticules favorise leur libération de l'endosome et/ou diminue leur stabilité. Néanmoins, des études de trafic intracellulaire et compétition devront être effectuées afin de confirmer ces hypothèses.

Abstract

Messenger mRNA is a molecule that has a strong potential in gene therapy for a wide variety of therapeutic applications such as vaccination against infectious disease or cancer, protein replacement, genome editing and stem cells reprogrammation. However, delivery of mRNA remains a scientific and technological endeavour as it is limited by many hurdles such as a fast degradation in plasma, low internalisation kinetics and a sequestration/degradation within endosomes. This endosomale barrier remains to day one of the hardest to overcome. To overcome some of these hurdles, delivery vehicles made of virus, lipids or polymers are developed worldwide. Chitosan (CS), a natural cationic polymer can bind and condense anionic nucleic acids to spontaneously form nanoparticles. These nanoparticles protect mRNA and help its cellular internalisation. However, the capacity of these nanoparticles to escape from endosomes is limited and could be augmented by adding endosomolytique agents into the nanoparticles. The main objective of this project was to incorporate an endosomolytique agent in CS/mRNA nanoparticle in order to increase their transfection efficiency. Poly(propylacrylic acid)(PPAA), an anionic synthetic polymer was used as endosomolytique agent and added at different concentrations in the binary (CS/mRNA) nanoparticles. These newly formed ternary nanoparticles (CS/mRNA/PPAA) had their physicochemical characteristics (size, PdI, zetapotential, pH) and transfection efficiency analysed. Furthermore, these formulations were made with/without buffer and with/without trehalose, a disaccharide used for lyophilisation of nanoparticles. In presence of buffer and trehalose, PPAA was mostly incorporated in the nanoparticles that had a size of 170 nm and a zeta potential of 12 mV. An augmentation of transfection efficiency (~10-fold) was observed for an intermediate PPAA concentration. This bioactivity was further improved by removing threlaose and increasing the mRNA mixing concentration while forming nanoparticles. This new optimal formulation reached a protein expression levels comparable to ~86% of the lipid control LipofectamineTM 2000 messenger max, without any signs of toxicity. These results suggest that PPAA in nanoparticles favorise their endosomal release and/or decrease their stability. Nevertheless, further studies such as intracellular trafficking and competition should be performed to confirm these hypotheses.