Développement de complexes polyélectrolytes à base d'acide hyaluronique et de chitosane pour la livraison d'ARN messager

Parmi les différents types de nanoparticules développés pour la livraison d'acides nucléiques, les complexes de polyélectrolytes (PEC), sont populaires en raison de leur facilité de production. Le chitosane (CS) est l'un des polycations les plus étudiés pour la livraison de matériel génétique thérapeutique dû à ses propriétés bénéfiques reconnues (biocompatibilité, biodégradabilité, absence de toxicité). Lorsqu'il est mélangé avec l'acide nucléique, il y a une formation spontanée de PEC via un processus principalement entraîné par de fortes attractions électrostatiques et un gain d'entropie associé à la libération de contre-ions. L'ajout d'acide hyaluronique (HA) aux nanoparticules CS/ARNm est une approche prometteuse pour la livraison d'ARNm, en raison du potentiel de combiner la capacité tampon du chitosane (effet éponge protonique) avec l'hémocompatibilité améliorée fournie par l'HA négativement chargée et l'internalisation médiée par récepteur de l'acide hyaluronique, ce qui pourrait conduire à l'administration ciblée de nombreuses tumeurs qui régulent positivement l'expression des récepteurs HA tels que CD44 et RHAMM. Contrairement à d'autres glycosaminoglycanes (GAG), l'HA n'est pas sulfaté et a une densité de charge relativement faible (une charge négative par dimère). En utilisant des HA sulfatés, la stabilité des nanoparticules est susceptible de s'améliorer en raison de sa densité de charge plus élevée qui lui confère une affinité de liaison plus élevée avec le chitosane chargé positivement. Pour cette raison, des nanoparticules HA-CS / ARNm avec des HA sulfatés et non sulfatés ont été préparées pour évaluer l'influence de la densité de charge de HA sur l'expression génique in vitro. L'objectif de cette étude était de déterminer les formulations optimales de nanoparticules CS/ARNm recouvertes de HA pour la livraison de gènes en étudiant l'effet des différents paramètres de formulation sur la bioactivité in vitro. Le projet a été conçu pour évaluer systématiquement l'influence des propriétés structurelles du CS et HA (poids moléculaires et densités de charge du chitosane et de l'acide hyaluronique) et la stoechiométrie des composants sur les propriétés physicochimiques des nanoparticules (NP) et l'efficacité de la transfection in vitro. Les différentes formulations de nanoparticules produites ont été caractérisées par leur taille et leur charge de surface en utilisant la diffusion de lumière dynamique (DLS). Ensuite ces nanoparticules ont été transfectées in vitro dans des cellules humaines du cancer du poumon exprimant la protéine EGFP (EGFP+ H1299) afin de normaliser le signal gène rapporteur (luciférase) avec la fluorescence EGFP et avoir ainsi des signaux relatifs à la densité cellulaire dans les puits. Les résultats ont démontré que les propriétés structurelles des polyélectrolytes (masse molaire, densité de charge) ainsi que le ratio molaire des charges positives et négatives durant le mélange ont un impact sur la bioactivité in vitro. La formulation optimale pour la livraison chez les cellules EGFP+ H1299 a été déterminée. Il s'agit de nanoparticules ternaires qui ont été formées avec une charge de surface positive (excès de chitosane) en utilisant de l'acide hyaluronique de 10 kDa ayant 1.4 groupes sulfates par dimère en combinaison avec un chitosane ayant une densité de charge élevée et une masse molaire faible ou l'inverse (c.a.d. DDA=80% avec Mn=10kDa, ou DDA=92-98% avec Mn=5kDa). Ces formulations présentent un équilibre adéquat entre l'avidité du système et la facilité de libération de l'ARNm, résultant en un niveau d'expression amélioré. La présence du HA sulfaté dans les nanoparticules résulte en une augmentation de la capacité d'internalisation cellulaire de ces systèmes de livraison de gènes. De plus, il a été observé que la présence de tréhalose dans ces PEC permet aussi d'augmenter l'expression génique in vitro. Le mécanisme impliqué dans cette dernière observation demeure inconnu. Des études subséquentes sont nécessaires pour chercher à comprendre le mécanisme qui fait en sorte que le tréhalose améliore la bioactivité in vitro et de vérifier si ce phénomène est observé in vivo.

Abstract

Among the different types of nanoparticles developed for gene delivery, polyelectrolyte complexes (PEC), or polyplexes, are a popular approach due to the ease of their production. Chitosan (CS) is one of the most studied biopolymers for the delivery of therapeutic compounds due to its à recognized beneficial properties (biocompatibility, biodegradability, lack of toxicity). When mixed with nucleic acid, there is a spontaneous formation of PEC via a process mainly driven by strong electrostatic attractions and an entropy gain associated with the release of counter-ions. Adding hyaluronic acid (HA) to CS/mRNA nanoparticles is a promising approach for mRNA delivery, due to the potential to combine the buffering capacity of chitosan (proton sponge effect) with improved hemocompatibility provided by the negatively charged HA, and receptor-mediated internalization of hyaluronic acid, which might lead to targeted delivery to numerous tumors that upregulate the expression of HA-receptors such as CD44 and RHAMM. Unlike other glycosaminoglycans (GAG), HA is not sulfated and has a relatively low charge density (one negative charge per dimer). By using sulfated HA polymers, nanoparticle stability is likely to improve due to the higher charge density of sulfated HA, which would lead to a higher binding affinity with the positively charged chitosan and an increased propensity for mRNA liberation in the cytoplasm, which is necessary for gene expression. For this reason, it was decided to prepare HA-CS/mRNA particles with sulfated as well as non-sulfated HAs to assess the influence of HA charge density on in vitro bioactivity. The goal of the project is to perform a screening of HA coated CS/mRNA nanoparticles designed for mRNA delivery to study the effect of different formulation parameters on in vitro bioactivity. The project was designed to systematically evaluate the influence of CS and HA macromolecular properties (molecular weights and charge densities of chitosan and hyaluronic acid), and components stoichiometry on the physicochemical properties of the nanoparticles and their in vitro transfection efficiency. The different formulations produced have been characterized for their size and surface charge using dynamic light scattering (DLS). Then these nanoparticles were transfected in vitro in human lung cancer cells expressing EGFP (EGFP+ H1299). Results suggest that the molecular properties of polyelectrolytes (molar mass, charge density) as well as the molar ratio of positive and negative charges during mixing have an impact on in vitro bioactivity. The optimal formulation for delivery in EGFP+ H1299 cells was determined. These are HA-CS/mRNA nanoparticles that have been formed with a net positive charge (thus with an excess of chitosan) using chitosan having a degree of deacetylation greater than 80% and a molecular weight of less than or equal to 10 kDa, and using sulfated hyaluronic acid with 1.4 sulfate groups per dimer and a molar mass of 10 kDa. It appears that this formulation results in polyelectrolyte complexes that are stable enough to protect the mRNA from nucleases and deliver it to the cells, while allowing for release of the mRNA into the cytoplasm. The presence of sulfated HA has demonstrated increased cell internalization capacity. In addition, it has been observed that the presence of trehalose in polyelectrolyte complexes increases gene expression in vitro. The mechanism involved in this observation remains obscure. Subsequent studies are needed to understand the mechanism by which trehalose improves in vitro bioactivity and whether this phenomenon is observed in vivo.