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Production du virus influenza dans des cellules HEK-293 cultivées en suspension

Audrey Anne Le Ru

Masters thesis (2010)

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Cite this document: Le Ru, A. A. (2010). Production du virus influenza dans des cellules HEK-293 cultivées en suspension (Masters thesis, École Polytechnique de Montréal). Retrieved from https://publications.polymtl.ca/303/
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Abstract

RÉSUMÉ Depuis plus de 30 ans, les cellules HEK-293 sont très largement utilisées par la communauté scientifique. Ces cellules, pouvant être cultivées en suspension dans du milieu sans sérum, représentent actuellement un des systèmes le plus efficace pour la production de protéines recombinantes et de vecteurs viraux par transfection à grande échelle. Cette lignée cellulaire est ainsi la plus employée pour la production d’adénovirus et adénovirus-associés, ainsi que de rétrovirus et lentivirus, et ce à des fins de thérapie génique. Plusieurs vecteurs viraux produits dans les cellules HEK-293 sont déjà en études cliniques de phases II et III. Une protéine produite par la compagnie Ely Lily est même déjà commercialisée. Alors que les virus influenza de types A et B sont responsables chaque année d'épidémies de par le monde, les vaccins antigrippaux sont toujours produits sur des oeufs embryonnés de poulet, malgré les importants désavantages que présente cette méthode. Alors même que les possibilités d'émergence de nouvelles pandémies sont très élevées, avec pour exemple récent celui de la grippe « porcine », il devient nécessaire de trouver de nouvelles alternatives rentables de production de ce vaccin à la fois plus sûres, plus rapides et plus efficaces. La culture de cellules de mammifères MDCK et VERO est déjà considérée depuis plusieurs années pour la production de souches virales d'influenza. Cependant ces lignées cellulaires présentent le désavantage notoire d'être cultivées en adhérence et dans un milieu contenant du sérum. Les cellules PER.C6 sont également à l'étude par la compagnie Sanofi Pasteur, mais aucune donnée sur le sujet n'a été publiée à ce jour. Différents laboratoires utilisent déjà les cellules HEK-293 en co-culture avec des MDCK afin de « récupérer » des souches influenza. Le but de cette étude était d'évaluer l’efficacité d’une plateforme d'expression utilisant les cellules HEK-293 pour la production de vaccin contre influenza. Les expériences ont été réalisées avec ces cellules cultivées en suspension dans du milieu sans sérum. Les premières études ont permis de mettre en évidence la présence des deux récepteurs de surfaces du virus (Sia2-3Gal et Sia2-6Gal) sur les cellules et donc le potentiel de ces cellules à être infectées. Les premières infections, réalisées en parallèles sur MDCK et HEK-293, ont confirmé cette hypothèse par l’obtention de titres viraux d’intérêt (640 HA/mL, 106 IVP/mL), bien que moindre à ceux obtenus avec la lignée de référence MDCK (2560 HA/mL, 1010 IVP/mL). Les objectifs suivants consistaient à optimiser les paramètres d’infection afin d’obtenir la meilleure production possible,----------ABSTRACT HEK-293 cell lines have been widely used for over 30 years by the scientific community. Currently HEK-293 cells are the most efficient system for the production of r-proteins and viral vectors by large-scale transfection of suspension-growing cells in serum-free medium. It is the most established cell line for the production of adeno- and adeno-associated viruses, retro-and lentiviruses for gene therapy applications. Numerous viral vectors produced in HEK-293 cells are currently involved in phase II and phase III clinical trials. Noteworthy, a protein manufactured by Ely Lily using an HEK-293 clone has been approved for commercialization. Influenza A and B viruses cause annual epidemics in the human population worldwide. Influenza vaccines are still produced using embryonated hen eggs despite important drawbacks. Considering the high probability of new influenza pandemics, like the recent swine flu H1N1, there is a need to find new alternative production methods for influenza vaccines. Mammalian cells such as MDCK or VERO have been considered for the production of influenza viral strains. However these strains present significant disadvantages of being cultivated in adherence and in serum containing medium. The human cell line PER.C6 is currently employed by Sanofi-Pasteur, but no data has been released to date. In many laboratories, HEK-293 clones have been used in combination with MDCK cells to rescue the influenza strains. This study was designed primarily to evaluate if the HEK-293 cell line could efficiently replicate the influenza virus. Experiments were performed in serum-free suspension cultures. Preliminary studies consisted in investigating the presence of Sia2-3Gal and Sia2-6Gal receptors on the cell surface to evaluate the potential of HEK-293 cells to be infected. First infections, done on both MDCK and HEK-293 cells, confirmed this hypothesis by leading to interesting viral titers (640 HA/mL, 106 IVP/mL), even though lower than those obtained with the MDCK reference cell line (2560 HA/mL, 1010 IVP/mL). Optimization of infection parameters to reach best yields and adaptation of the virus to the cell line were the next points investigated. The effect of trypsin on cells during infection was first studied. Best production was obtained at a 1μg/mL concentration, which allowed virus activation without inhibiting effect on the cells. Low multiplicity of infection (moi=10-3) at infection efficiently amplified the virus strain without leading non-infected cells to apoptosis. The infection conditions (1x106 cell/mL, 1μg/mL trypsin,

Open Access document in PolyPublie
Department: Département de génie chimique
Dissertation/thesis director: Olivier Henry and Amine Kamen
Date Deposited: 23 Jun 2010 15:25
Last Modified: 24 Oct 2018 16:10
PolyPublie URL: https://publications.polymtl.ca/303/

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