Développement d'une sonde portable d'imagerie Raman pour guider l'exérèse de tumeur

Suite au diagnostic d'un cancer, l'un des premiers traitements appliqués est la résection du tissu cancéreux par un chirurgien. Afin d'assurer le meilleur pronostic au patient, il est important que le chirurgien minimise la quantité de tissu et de cellules cancéreuses résiduels après la chirurgie puisque celles-ci augmentent la probabilité de récurrence du cancer. Dû au manque actuel d'outils permettant de guider le chirurgien, ce dernier doit bien souvent utiliser l'inspection visuelle et la palpation des tissus pour identifier la nature de ces derniers. Ces techniques sont très subjectives et elles ne sont généralement pas assez sensibles pour identifier les infiltrations de cellules cancéreuses ce qui mène souvent à une résection incomplète ou trop agressive des tissus. Il existe donc un réel besoin pour un instrument capable de guider le chirurgien afin de minimiser les risques associés à la résection et d'assurer une exérèse plus complète de la tumeur. Dans les dernières années, plusieurs sondes basées sur la spectroscopie Raman ont démontré leur potentiel pour guider le chirurgien dans la résection des tissus cancéreux en utilisant le contraste moléculaire des tissus. La plupart des implémentations actuelles se présentent sous la forme de sondes d'acquisition ponctuelle ou d'aiguilles dont le volume d'interrogation est restreint à moins de 500 μm de diamètre. D'autre part, le développement d'une sonde d'imagerie Raman ayant un plus grand champ de vue pourrait permettre une analyse moléculaire contextuelle du tissu atteint et ainsi améliorer la localisation des marges et des infiltrations de la tumeur. Dans ce mémoire, deux preuves de concepts de sondes d'imagerie Raman sont présentées. Ceux-ci ont démontré le potentiel futur de développer une sonde d'imagerie Raman capable d'imager un champ de vue de quelques millimètres de diamètre pour guider le chirurgien dans la résection de tumeur. Une première preuve de concept de sonde d'imagerie Raman a été assemblée pour démontrer la possibilité d'utiliser une matrice cohérente de fibres optiques pour faire de l'imagerie Raman à travers un câble flexible. La reconstruction des images hyperspectrale s'est faite à partir d'un filtre accordable à base de cristaux liquides et d'une caméra EMCCD. Le système a démontré sa capacité à reconstruire des images Raman sur un champ de vue de 25 mm2 avec une résolution spatiale de 55 μm. Un spectre Raman est associé à chaque pixel de l'image couvrant la plage spectrale de 453 à 1749 cm-1 avec une résolution moyenne de 95 cm-1. Pour valider les performances de la nouvelle sonde d'imagerie, des spectres individuels acquis par celle-ci ont été comparés à des spectres acquis par une sonde ponctuelle ayant déjà fait ses preuves. Une forte corrélation avec un coefficient de Pearson moyen R = 0.82 a été observée entre les spectres acquis avec les deux sondes sur des tissus adipeux et musculaires de viande porcine. La sonde d'imagerie a aussi démontré sa capacité à recréer des images moléculaires sur ces mêmes tissus en utilisant la classification par réseau de neurones. Toutefois, cette première implémentation s'est avérée très limitée par son très bas rapport signal sur bruit et sa faible résolution spectrale. De ce fait, plusieurs composants spectraux n'ont pas pu être imagés, limitant ainsi la possibilité du système à classifier des tissus dont le contraste moléculaire est plus faible telle que les tissus cancéreux et les tissus sains. De plus, cette première implémentation n'a pas permis de complètement refléter le concept d'une sonde facilement malléable avec des ports d'illumination et de détection séparés. Il demeure qu'il s'agit de la première utilisation dans la littérature d'une matrice cohérente de fibres pour faire de la spectroscopie Raman sur un champ de vue de quelques millimètres sur des échantillons biologiques. Une deuxième preuve de concept a été assemblée dans le but de surmonter les limitations de la première implémentation et d'atteindre des spécifications plus près des requis pour l'incorporation en clinique. Le but principal de cette deuxième implémentation consistait à reproduire des spectres Raman similaires à ceux de la sonde ponctuelle sur un champ de vue de quelques millimètres. La nouvelle sonde a été construite en utilisant la même matrice de fibres optiques, mais en changent le système de détection pour un miroir rotatif combiné à un spectromètre d'imagerie afin d'accroître le rapport signal sur bruit et la résolution spectrale. La sonde a été redésignée de sorte à combiner l'illumination et la détection à l'intérieur d'un même port. Le système final a démontré sa capacité à recréer des spectres Raman avec une résolution spectrale de 6 cm-1 sur un champ de vue de 14 mm2 et une résolution spatiale supérieure à 115 μm. La meilleure résolution spectrale a permis l'identification de plusieurs pics Raman déjà répertoriés dans la littérature associés au contenu en protéine et en lipides des tissus de viande porcine et du cerveau de veau. La comparaison des spectres individuels du nouveau système avec la sonde ponctuelle a démontré une meilleure corrélation avec un coefficient de Pearson R>0.85. En utilisant les ratios entre les pics de protéines et de lipides, il a été possible de mettre en contraste les tissus adipeux et musculaires sur la viande porcine et la matière blanche et grise sur le cerveau de veau. Le système présenté dans ce projet de maîtrise pourrait potentiellement être adapté et utilisé à titre de sonde ou d'endoscope pour guider les chirurgies et ainsi assurer une résection plus complète des tumeurs.

Abstract

One of the first line of defense against solid cancer is the surgical resection of all the cancerous tissue by a surgeon. Residual cancer tissue and cells left after the surgery directly impact patient outcome with a higher probability of recurrence, therefore complete resection is important to ensure the best patient prognosis. From the actual lack of surgical guidance instruments, most of the time the surgeon must rely on visual inspection and palpation of the tissue. Those techniques are highly subjective and their lack of sensibility for detecting cancerous cell infiltration often leads to incomplete or overly aggressive resection. There is currently a need for surgical guidance instruments that could help the surgeon perform a more complete cancer resection while improving the safety of the procedure. Raman spectroscopy has shown great promise in the development of fiber-optic probes that have the potential to help the surgeon differentiate between cancerous and normal tissue based on molecular contrast. Up to now, most development led to single point probe or needle with interrogation volumes of less than 500 μm diameter. However, spatial registration of multiple spectra through a mesoscopic wide-field Raman probe could provide clinicians with molecular contextual information to facilitate the localization of tumor margins and infiltration. Here we present two proofs of concepts towards the development of a wide-field Raman probe that could potentially help surgeons in tumor margin assessment. A first proof-of-concept study shows that spontaneous Raman spectroscopy could be achieved on a large field-of-view through a flexible cable using a coherent bundle of fibers. Reconstruction of hyperspectral images was done using a liquid crystal tunable filter combined with an EMCCD camera. We demonstrated that the developed system is able to recreate a Raman image over a field of view of 25 mm2 with a spatial resolution of 55.7 μm through a flexible cable. Each pixel of the Raman image formed a Raman spectrum covering the spectral range from 453 to 1749 cm-1 with an average spectral resolution of 95 cm-1. Individual fat and adipose tissue of porcine meat spectra of the Raman image correlated well with spectra acquired with an established single point Raman probe with an average Pearson correlation factor of 0.82. Tissue maps were reconstructed based on the molecular contrast generated by Raman spectroscopy using neural network classification. However, this first implementation was limited by the very low signal to noise ratio and a poor spectral resolution. This does not allow the detection of important spectral features required for classification of tissue with subtler molecular differences as cancerous tissue. In addition, the system implementation did not completely reflect the intention to develop a handheld probe with two separate systems to perform the illumination and detection. Nonetheless, this proof of concept was the first in the literature to show a wide-field Raman spectroscopy over a few millimeters through a coherent bundle of fibers on biological samples. A second proof-of-concept was designed to overcome the limitations of the previous system and to reach suitable specifications for clinical translation. The principal goal of this second prototype was to collect spectra comparable to the established single point Raman probe over a large field of view of a few millimeters. The same coherent bundle fiber was used, with a new detection system involving a rotating mirror combined with an imaging spectrometer to increase spectral resolution and signal to noise ratio. The probe was redesigned to combine the illumination and detection through one end. The system provided Raman spectrum with spectral resolution of 6 cm-1 in each pixel of a 14mm2 image with a spatial resolution below 115 μm. The improved spectral resolution has led to the identification of several peaks of proteins and lipids already reported in the literature over samples of calf brain and swine tissue. Individual spectra from Raman images compared well with the single point Raman probe measurements with a Pearson correlation factor above 0.85. Calf brain and porcine meat tissue maps were reconstructed using peak ratios associated with protein and lipids. Those maps clearly depicted the contrast between adipose and muscle tissue of porcine tissue and contrast between gray and white matter of calf brain. The system presented here have the potential to be translated for clinical use as an intraoperative probe or endoscope to guide the surgeon to minimize the amount of residual pathological tissue after surgery.