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Metabolomics and Dynamic Metabolic Flux Analysis in ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) Fermentation

Xinhe Zhao

PhD thesis (2017)

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Cite this document: Zhao, X. (2017). Metabolomics and Dynamic Metabolic Flux Analysis in ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) Fermentation (PhD thesis, École Polytechnique de Montréal). Retrieved from https://publications.polymtl.ca/2700/
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Abstract

De nos jours, les hydrolysats d'hémicelluloses, des matières premières riches en glucides issues des procédés papetier et forestier, sont largement étudiés pour le développement de procédés de bioraffinerie forestière pour la production de biobutanol, un biodiésel de remplacement du pétrole. Une des avenues biotechnologiques les plus étudiées à ce jour est la fermentation ABE (acétone-butanol-éthanol) par la bactérie Clostridium acetobutylicum. Cependant, certains inhibiteurs de la fermentation ABE sont générés lors du procédé de prétraitement et d’hydrolyse, ce qui limite grandement l'utilisation de ces biomasses riches en substrats peu coûteux. D’autre part, les pratiques actuelles de culture mènent à des rendements en butanol qui ne sont pas suffisants pour assurer la mise en place d’unités industrielles de production qui soient économiquement profitables. L'objectif de ce projet de recherche visait donc à améliorer la productivité du bioprocédé de fermentation ABE, dans un contexte de bioraffinage forestier, par l’amélioration des connaissances et le développement de stratégies de culture. Un milieu synthétique contenant du xylose comme source principale de carbone a été utilisé pour simuler un hydrolysat d’hémicelluloses d’épinette noire pour un bioprocédé de fermentation avec la bactérie Clostridium acetobutylicum. Tout d'abord, nous avons étudié l’effet d’une concentration élevée en chlorure de sodium sur le comportement du bioprocédé. En effet, une quantité élevée en hydroxyde de sodium est ajouté lors du procédé de délignification des copeaux de bois, au préalable de l’étape d’hydrolyse, cet ajout tient au fait du contrôle pH ainsi que pour son pouvoir caustique comme agent de nettoyage. Ainsi, compte tenu de l’intérêt à utiliser cette solution d’hydrolysats d’hémicellulose, il est considéré comme crucial d’évaluer l’effet de cette haute concentration en sodium sur la fermentation ABE. Une concentration seuil de sodium de 200 mM, soit ce qui est normalement mesuré en industrie, a été utilisée et comparée à une culture témoin avec la souche Clostridium acétobutylicum ATCC 824. Les résultats ont révélé que la biomasse et l'ABE étaient sérieusement inhibés par une concentration élevée en sodium, avec une diminution respectivement de 19.50 ± 0.85 % (biomasse), 35.14 ± 3.50 % (acétone), 33.37 ± 0.74 % (butanol) et 22.95 ± 1.81 % (éthanol). De manière intéressante, les productivités spécifiques cellulaires en solvants ont été maintenues comparativement à la culture témoin. Une étude approfondie du métabolisme intracellulaire a permis d’identifier que l'effet principal d’une concentration élevée en sodium se concentre principalement sur la phase d’acidogénèse, phase préalable et requise pour procéder en phase solvantogénèse lors de laquelle les solvants sont produits. Les intermédiaires métaboliques associés à la voie des pentoses phosphates et à la glycolyse ont alors été respectivement inhibés de 80.73 ± 1.47 % et de 68.84 ± 3.42 % face à la culture contrôle sans ajout de sodium. Cependant, l'ATP et le NADH ont été accumulés pendant cette période alors que le ratio entre le NADP+ et le NADPH est demeuré constant pour toute la durée de la culture; un phénomène pouvant être relié à la forte hausse de productivité spécifique en solvants. Dans un deuxième temps, l’effet de la présence d’acétate sur la fermentation ABE a été étudié, compte tenu que ce composé est généré en quantité non négligeable lors de l’étape d’hydrolyse des hémicelluloses. Or, par un heureux hasard, les cultures implémentées initialement avec une concentration en acétate de sodium de 60 mM ont mené à la production d’une quantité élevée de riboflavine, atteignant un maximum ~ 0,2 g L-1 (0,53 mM) contre 0,057 mM dans la culture témoin, soit une augmentation d’un facteur 10x. Parallèlement à une augmentation marquée de production de riboflavine, la production de solvants et le rendement en biomasse ont même été simultanément favorisés. De façon intéressante, l'addition d'acétate a également stimulé l'accumulation intracellulaire de NADH, ce qui a pu contribuer, finalement, à affecter d’autres voies métaboliques par régulation redox. L'analyse métabolique intracellulaire a également permis de spéculer sur les flux stimulés ou inhibés en présence d’acétate et qui les métabolites accumulés lors de l’étape d’acidogénèse vers la phase de solvantogénèse pour la production de solvants. Finalement, un modèle métabolique cinétique a été développé pour simuler ce système de production ABE coproducteur de riboflavine, et utilisé pour l'analyse de la dynamique des flux métaboliques. La cinétique de chaque flux métabolique ainsi que de la croissance de la biomasse sont décrites selon une cinétique de type Michaelis-Menten. Le mécanisme d'activation de la formation de riboflavine et de butanol par l'acétate, ainsi que les mécanismes d'inhibition de la croissance de la biomasse et l'absorption du xylose par le butanol ont été décrits. Le modèle comprend 24 réactions, 23 métabolites et 72 paramètres. La structure du modèle ainsi que la valeur de ses paramètres biocinétiques ont été déterminées en confrontant les simulations du modèle à des données expérimentales en bioréacteur de 3,5 L, en concentrant l’étude des paramètres sensibles identifiés par une étude de sensibilité. Ainsi, le modèle a montré être en mesure de simuler divers phénomènes métaboliques reliés à la transition de la phase acidogène à la phase solvantogène, soit une étape cruciale à l’induction de la production en solvants. Parallèlement, l'analyse dynamique des flux métaboliques, via les simulations du modèle, a permis de révéler que les taux de formation de riboflavine (ribA) et de guanosine triphosphate (GTP, précurseur de la riboflavine) (PurM), étaient tous deux fortement stimulés par l'ajout d’acétate, avec une activité de 9,4 fois et 9,7 fois au moment initial, respectivement. Cette étude supporte donc notre hypothèse que l’ajout d’acétate favorise une stimulation de flux les métabolites accumulés lors de l'acidogénèse vers la production de solvants dans la phase de solvantogénèse. Enfin, une simulation différente de la concentration initiale en acétate a montré que ce modèle était robuste pour prédire l'ABE et la coproduction de riboflavine dans un milieu de culture contrôle sans ajout d’acétate. En conclusion, cette thèse portant sur l’étude du comportement métabolique d’un bioprocédé de fermentation ABE à l’aide de Clostridium acetobutylicum ATCC 824, apporte des idées, des résultats et des outils qui contribueront à l’établissement de bioprocédés de production de biobutanol, valorisant des résidus d’hydrolysats d’hémicellulose, qui soient économiquement viables. ---------- Nowadays, hemicellulose hydrolysates - sugar-rich feedstocks issued from the pulp-and-paper and forestry industries - are being greatly investigated in butanol biorefinery. Among various biotechnological platforms under study to produce butanol, the acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation process with Clostridium acetobutylicum seems to be the most studied avenue. However, some inhibitors are generated in the pre-treatment and hemicellulose hydrolysis processes, with compounds which are inhibitors of ABE fermentation. Moreover, the productivity yields of the ABE bioprocess are still low and barely enable the economic feasibility of such a bioprocess at an industrial scale, despite the low cost of these feedstocks. Therefore, the main objective of this thesis is focused on ameliorating our fundamental knowledge of ABE fermentation in order to enable the identification of potential bioprocess improvement strategies. The aim of this research is thus to contribute to the development of biobutanol industrialization. A synthetic medium with xylose as the main carbon source was used to simulate hemicellulose hydrolysates of black spruce, used in the pulp-and-paper and forestry industries, and Clostridium acetobutylicum was the culture used to perform ABE fermentation. In the first part, we evaluated the effect of a high sodium chloride concentration in ABE fermentation, since large amounts of sodium hydroxide are applied to wood chips during the hydrolysis process such as in delignification, pH control, and as caustic cleaning agents. These processes then artificially increase the sodium concentration of the resulting solution, and since this solution is to be used as a culture medium for ABE fermentation, it is crucial to characterize the effects of such a high sodium content. A sodium concentration of 200 mM, a level normally observed in industry, was thus assessed and compared to a control culture. The Clostridium acetobutylicum ATCC 824 strain was studied, and a high sodium condition was shown to affect biomass growth and ABE yield, but not the cell-specific productivity in ABE. A further metabolomics study showed that a high sodium concentration mainly influenced the acidogenic phase and biomass synthesis. The ABE fermentation process normally requires an acidogenic phase first, in order to proceed to the solventogenic phase during which solvents are produced, so during acidogenesis, high sodium conditions were shown to inhibit the intermediate metabolites concentration of the pentose phosphate pathway and glycolysis pathways of up to 80.73  1.47 % and 68.84  3.42 %, respectively. However, ATP and NADH were stimulated at high sodium, while the NADP+-to-NADPH ratio was constant for the entire culture duration, a phenomenon which may explain the robustness of solvents’ specific productivities even under a sodium stress. In the second part, we investigated the effect of supplementing acetate on ABE fermentation, since this compound is generated in non-negligible amounts during the hemicellulose hydrolysis step. Indeed, supplementing the culture medium at 60 mM sodium acetate led to the production of a yellow sediment clearly identified as riboflavin. We thus observed that a 60 mM acetate supplementation leads to a 10-fold increase of riboflavin, reaching up to ~ 0.2 g L-1 (0.53 mM) compared to 0.057 mM in the control culture. A metabolomic study showed that acetate supplementation resulted in a higher consumption of GTP, which is the precursor of riboflavin. Moreover, solvents production and biomass yield were also promoted when adding acetate. Interestingly, acetate addition clearly stimulated the accumulation of the reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide (i.e. NADH), which could have affected other metabolic pathways though redox regulation mechanisms. Our metabolomic study also suggests that a high acetate condition stimulates the mobilization of various metabolic intermediates accumulated in acidogenesis towards solvents production in solventogenesis. In the third part, a kinetic metabolic model was developed in order to better understand the effect of adding acetate by simulating the ABE-coproducing riboflavin process and performing a dynamic metabolic flux analysis. Each step in flux kinetics, as well as the biomass specific growth rate, was described using the Michaelis-Menten type approach. The activation mechanism of riboflavin and butanol formation by acetate, as well as the inhibition mechanisms of biomass growth and xylose uptake by butanol, were described. The model includes 24 reactions, 23 metabolites, and 72 parameters. Model structure as well as kinetic parameter value were determined by minimizing simulation errors of experimental data for 3.5-L bioreactor cultures at 60 mM acetate condition. Indeed, the model was shown to be capable of adequately simulating experimental data and predicting culture behavior without acetate addition, as well as the transition from acetogenesis to solventogenesis - a crucial step in the induction of solvents production. Moreover, a dynamic metabolic flux analysis suggests that the riboflavin (ribA) and guanosine triphosphate (GTP, precursor of riboflavin) formation rates (PurM) were strongly stimulated by high acetate with 9.4-fold and 9.7-fold activity early following inoculation, respectively. This in silico study further suggests that a high acetate condition stimulates fluxes which dredged accumulated metabolites in acidogenesis for solvents production. In conclusion, this work on the investigation of the metabolic behavior of ABE fermentation with Clostridium acetobutylicum ATCC 824 has brought thoughts, results, and tools which may contribute to enabling the economic feasibility of producing butanol valorizing hemicellulose hydrolysates wastes.

Open Access document in PolyPublie
Department: Département de génie chimique
Dissertation/thesis director: Mario Jolicoeur
Date Deposited: 30 Oct 2017 14:50
Last Modified: 24 Oct 2018 16:12
PolyPublie URL: https://publications.polymtl.ca/2700/

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