Metabolomics and Dynamic Metabolic Flux Analysis in ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) Fermentation

De nos jours, les hydrolysats d'hémicelluloses, des matières premières riches en glucides issues des procédés papetier et forestier, sont largement étudiés pour le développement de procédés de bioraffinerie forestière pour la production de biobutanol, un biodiésel de remplacement du pétrole. Une des avenues biotechnologiques les plus étudiées à ce jour est la fermentation ABE (acétone-butanol-éthanol) par la bactérie Clostridium acetobutylicum. Cependant, certains inhibiteurs de la fermentation ABE sont générés lors du procédé de prétraitement et d'hydrolyse, ce qui limite grandement l'utilisation de ces biomasses riches en substrats peu coûteux. D'autre part, les pratiques actuelles de culture mènent à des rendements en butanol qui ne sont pas suffisants pour assurer la mise en place d'unités industrielles de production qui soient économiquement profitables. L'objectif de ce projet de recherche visait donc à améliorer la productivité du bioprocédé de fermentation ABE, dans un contexte de bioraffinage forestier, par l'amélioration des connaissances et le développement de stratégies de culture. Un milieu synthétique contenant du xylose comme source principale de carbone a été utilisé pour simuler un hydrolysat d'hémicelluloses d'épinette noire pour un bioprocédé de fermentation avec la bactérie Clostridium acetobutylicum. Tout d'abord, nous avons étudié l'effet d'une concentration élevée en chlorure de sodium sur le comportement du bioprocédé. En effet, une quantité élevée en hydroxyde de sodium est ajouté lors du procédé de délignification des copeaux de bois, au préalable de l'étape d'hydrolyse, cet ajout tient au fait du contrôle pH ainsi que pour son pouvoir caustique comme agent de nettoyage. Ainsi, compte tenu de l'intérêt à utiliser cette solution d'hydrolysats d'hémicellulose, il est considéré comme crucial d'évaluer l'effet de cette haute concentration en sodium sur la fermentation ABE. Une concentration seuil de sodium de 200 mM, soit ce qui est normalement mesuré en industrie, a été utilisée et comparée à une culture témoin avec la souche Clostridium acétobutylicum ATCC 824. Les résultats ont révélé que la biomasse et l'ABE étaient sérieusement inhibés par une concentration élevée en sodium, avec une diminution respectivement de 19.50 ± 0.85 % (biomasse), 35.14 ± 3.50 % (acétone), 33.37 ± 0.74 % (butanol) et 22.95 ± 1.81 % (éthanol). De manière intéressante, les productivités spécifiques cellulaires en solvants ont été maintenues comparativement à la culture témoin. Une étude approfondie du métabolisme intracellulaire a permis d'identifier que l'effet principal d'une concentration élevée en sodium se concentre principalement sur la phase d'acidogénèse, phase préalable et requise pour procéder en phase solvantogénèse lors de laquelle les solvants sont produits. Les intermédiaires métaboliques associés à la voie des pentoses phosphates et à la glycolyse ont alors été respectivement inhibés de 80.73 ± 1.47 % et de 68.84 ± 3.42 % face à la culture contrôle sans ajout de sodium. Cependant, l'ATP et le NADH ont été accumulés pendant cette période alors que le ratio entre le NADP+ et le NADPH est demeuré constant pour toute la durée de la culture; un phénomène pouvant être relié à la forte hausse de productivité spécifique en solvants. Dans un deuxième temps, l'effet de la présence d'acétate sur la fermentation ABE a été étudié, compte tenu que ce composé est généré en quantité non négligeable lors de l'étape d'hydrolyse des hémicelluloses. Or, par un heureux hasard, les cultures implémentées initialement avec une concentration en acétate de sodium de 60 mM ont mené à la production d'une quantité élevée de riboflavine, atteignant un maximum ~ 0,2 g L-1 (0,53 mM) contre 0,057 mM dans la culture témoin, soit une augmentation d'un facteur 10x. Parallèlement à une augmentation marquée de production de riboflavine, la production de solvants et le rendement en biomasse ont même été simultanément favorisés. De façon intéressante, l'addition d'acétate a également stimulé l'accumulation intracellulaire de NADH, ce qui a pu contribuer, finalement, à affecter d'autres voies métaboliques par régulation redox. L'analyse métabolique intracellulaire a également permis de spéculer sur les flux stimulés ou inhibés en présence d'acétate et qui les métabolites accumulés lors de l'étape d'acidogénèse vers la phase de solvantogénèse pour la production de solvants. Finalement, un modèle métabolique cinétique a été développé pour simuler ce système de production ABE coproducteur de riboflavine, et utilisé pour l'analyse de la dynamique des flux métaboliques. La cinétique de chaque flux métabolique ainsi que de la croissance de la biomasse sont décrites selon une cinétique de type Michaelis-Menten. Le mécanisme d'activation de la formation de riboflavine et de butanol par l'acétate, ainsi que les mécanismes d'inhibition de la croissance de la biomasse et l'absorption du xylose par le butanol ont été décrits. Le modèle comprend 24 réactions, 23 métabolites et 72 paramètres. La structure du modèle ainsi que la valeur de ses paramètres biocinétiques ont été déterminées en confrontant les simulations du modèle à des données expérimentales en bioréacteur de 3,5 L, en concentrant l'étude des paramètres sensibles identifiés par une étude de sensibilité. Ainsi, le modèle a montré être en mesure de simuler divers phénomènes métaboliques reliés à la transition de la phase acidogène à la phase solvantogène, soit une étape cruciale à l'induction de la production en solvants. Parallèlement, l'analyse dynamique des flux métaboliques, via les simulations du modèle, a permis de révéler que les taux de formation de riboflavine (ribA) et de guanosine triphosphate (GTP, précurseur de la riboflavine) (PurM), étaient tous deux fortement stimulés par l'ajout d'acétate, avec une activité de 9,4 fois et 9,7 fois au moment initial, respectivement. Cette étude supporte donc notre hypothèse que l'ajout d'acétate favorise une stimulation de flux les métabolites accumulés lors de l'acidogénèse vers la production de solvants dans la phase de solvantogénèse. Enfin, une simulation différente de la concentration initiale en acétate a montré que ce modèle était robuste pour prédire l'ABE et la coproduction de riboflavine dans un milieu de culture contrôle sans ajout d'acétate. En conclusion, cette thèse portant sur l'étude du comportement métabolique d'un bioprocédé de fermentation ABE à l'aide de Clostridium acetobutylicum ATCC 824, apporte des idées, des résultats et des outils qui contribueront à l'établissement de bioprocédés de production de biobutanol, valorisant des résidus d'hydrolysats d'hémicellulose, qui soient économiquement viables.