Gene Silencing Using Chitosan Based siRNA Delivery Systems in Cells and Animals

Le développement de vecteurs de livraison non viraux à des fins thérapeutiques a pris de l'ampleur dans les dernières années. Le chitosane est un polymère cationique naturel ayant la capacité de former des nanoparticules lorsqu'il est mélangé à des molécules polyanioniques comme les petits ARN interférents (pARNi). Les efforts pour identifier les paramètres moléculaires favorisant une bioactivité optimale n'ont pas été concluants en raison de différences expérimentales, d'un manque d'uniformité des protocoles de transfection, de la faible caractérisation du polymère et des différences au niveau des sources de chitosane utilisé. Cette thèse a été entreprise afin de répondre aux objectifs suivants: 1) Tester et valider l'efficacité de transfection de formulations, précédemment identifiées comme optimales pour la livraison d'ADN plasmidique, 2) Examiner l'influence des paramètres intrinsèques (dégrée de deacetylation (DDA), la masse moléculaire (Mn) et le ratio N:P) et extrinsèques (sérum, pH, force ionique et conditions de mélange) sur les caractéristiques physicochimiques des particules, leur internalisation dans les cellules, l'efficacité de silençage, la toxicité métabolique, la génotoxicité et l'hémocomptabilité, en utilisant une chimiothèque de chitosanes hautement caractérisés, et 3) Sélectionner des formulations ayant des caractéristiques optimales relatives à la taille, le potentiel zêta, l'intégrité des nanoparticules et la capacité de ces dernières à induire un silençage spécifique du gène en question tout en étant sécuritaire, et 4) Caractériser la biodistribution des nanoparticules, leurs toxicités et leurs potentiel de silençage génique suite à des injections intraveineuses chez la souris. Une étude initiale a démontré que le chitosane interfère avec l'extraction d'acide nucléique de cellules transfectées in vitro. Une méthode enzymatique simple et peu coûteuse a permis de récupérer l'ARN totale pour des applications moléculaires tel que la PCR en temps réel. De plus, cette étude a permis de réduire le biais (~ 10-15 %) associé aux nanoparticules adsorbées à la surface des cellules lors de mesures du niveau d'internalisation par cytométrie en flux. En outre, la digestion enzymatique du chitosane pourrait être effectuée en présence de guanidium, un agent chaotropique présent dans le tampon de lyse, démontrant ainsi l'efficacité et la simplicité de cette méthode. Avec la résolution de cet obstacle technique, nous avons sélectionné des formulations ayant démontré, auparavant, une efficacité de transfection élevée pour la livraison d'ADN plasmidique. Ces formulations ont été caractérisés pour leur taille, leur forme, leur potentiel surfacique (potentiel zêta), leur capacité de protéger les pARNi contre les nucléases et leur efficacité à transfecter, de façon non toxique, différentes lignées cellulaires. Les nanoparticules ainsi formées étaient sphériques et leur taille variait entre 40 et 100 nm. De plus, les résultats ont démontré que la protection contre les nucléases dépendait de la masse moléculaire et du ratio N:P. Par ailleurs, une haute efficacité (~80%) de silençage génique, en présence de sérum (10%), a pu être atteinte dans plusieurs lignées cellulaires. Pour la première fois, des nanoparticules avaient pu être obtenues à un faible ratio N:P marquant ainsi une différence frappante avec la littérature. Nos résultats ont pu démontrer la cause de ce bais favorisant la sélection de nanoparticules à haut ratio N :P testée dans la littérature. Dans la perspective de comprendre l'influence du degré de désacétylation (DDA) et de la masse moléculaire (Mn) du chitosane ainsi que du ratio N :P sur l'efficacité de transfection in vitro, la toxicité, la génotoxicité, l'hémocompatibilité et la biodistribution in vivo, une chimiothèque de chitosans hautement caractérisés a été produite à de différents DDA (98%, 92%, 80% et 72%) et Mn (5, 10, 40, 80 et 120 kDa) et mélangée avec des pARNi à des ratios N :P de 5 :1 et 30 :1. Les nanoparticules, ainsi formées, ont été caractérisées pour leurs tailles et potentiel surfacique en présence de 10 et 150 mM de sel. L'efficacité d'encapsulation (EE) et de transfection a été mesurée à pH 6.5 et 8 (EE) et à pH 6.5 et 7.4 respectivement. Les formulations les plus performantes ont été sélectionnées pour une caractérisation plus poussée de l'influence de la Mn et du ratio N:P sur l'internalisation des nanoparticules, l'activité métabolique cellulaire, la génotoxicité et l'efficacité de transfection in vitro en présence de sérum. L'hémocompatibilité et la biodistribution in vivo ont également été examinées pour différents Mn, ratios N :P et doses. Nos résultats ont démontré que l'internalisation des nanoparticules et l'efficacité de silençage étaient positivement corrélées à l'augmentation du potentiel surfacique, obtenu en augmentant le DDA et la Mn. Une longueur minimale de ~60-70 monomères (Mn ~10 kDa) était requise pour garantir une stabilité et un silençage en présence ou absence de sérum. L'efficacité de silençage a atteint des niveaux équivalents (~ 80-90%) à ceux du contrôle positif (DharmaFECT®) sans toxicité métabolique ou génotoxicité démontrant ainsi la supériorité de notre système comparativement aux lipides cationiques qui ont diminué l'activité métabolique des cellules. La présence de concentration croissante de sérum a négativement influencé la transfection in vitro. Nos résultats indiquent que l'influence négative du sérum est inversement proportionnelle à une augmentation du DDA, de la Mn et du ratio N :P. L'hémocompatibilité s'est révélée être dépendante de la dose, du DDA et de la masse moléculaire suggérant ainsi l'utilisation d'acide hyaluronique (HA), un polymère anionique et biocompatible, pour diminuer l'interaction avec les composantes du sang et améliorer la stabilité colloïdale. Les études de toxicité in vivo ont démontré que les nanoparticules de chitosane formulées à N:P 5 pourraient être tolérées jusqu'à une dose de 2.5mg/kg siRNA, tandis que celles revêtues de HA améliorent la tolérabilité par un facteur d'au moins 4. Contrairement aux nanoparticules lipidiques, les nanoparticules avec ou sans revêtement n'ont ni entraîné l'expression de cytokines pro-inflammatoires (ex. IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ et KC) ni l'augmentation de biomarqueurs sérologiques tels que l'ALT, AST, ALP, l'urée sanguine, et la créatinine. Une diminution des thrombocytes a été uniquement observée avec les formulations lipidiques soulignant ainsi des différences majeures avec le chitosane. L'analyse histopathologique des tissus et le suivit des masses corporelles ont confirmés le profil d'innocuité observé avec le chitosane. L'étude de biodistribution chez la souris démontre une accumulation spécifique de nanoparticules dans les tubules épithéliaux proximaux du rein où 40-50% de silençage a été observé, suggérant ainsi des applications potentielles du système au niveau des maladies rénales.

Abstract

Research to develop safe and efficient non-viral gene delivery vectors for clinical applications has gained momentum in recent years. Chitosan is a natural cationic polymer with a characteristic property of self-assembly with small interfering RNA (siRNA) to form nanoparticles with high in vitro and in vivo transfection efficiencies. Previous efforts to identify molecular parameters favoring optimal bioactivity failed to produce conclusive results because of experimental discrepancies, lack of uniformity in transfection protocols, differences in chitosan sources, and poor characterization. In the light of these lacunae, The project presented in this thesis was carried out with the following objectives 1) Test and validate the transfection efficiency of formulations, previously identified as optimal for plasmid DNA, 2) Investigate the effect of intrinsic (DDA, Mn and N:P ratio) and extrinsic parameters (serum, pH, ionic strength and mixing conditions) on nanoparticle physicochemical characteristics, in vitro cell uptake, knockdown efficiency, metabolic toxicity, genotoxicity and hemocompatibility using a library of precisely characterized chitosans, and 3) Identify formulations with optimal characteristics with respect to size, surface charge, integrity, knockdown, toxicity followed by the characterization of their in vivo biodistribution; toxicity and gene knockdown potential following intravenous administration. An initial study demonstrated that chitosan interferes with column based extractions of total RNA from low cell numbers. The digestion of chitosan using a relatively simple and inexpensive enzymatic method permitted total recovery of high-quality RNA. In addition, surface bound chitosan was shown to bias flow cytometry data, evaluating nanoparticle uptake through fluorescently labeled siRNA. Treatment of cells using the chitosanase method reduced false positive events by around 10-15%. Surprisingly, enzymatic digestion could be performed in guanidium, a chaotropic agent, containing lysis buffer demonstrating the convenience of the method and allowing for the extracted RNA to be used in quantitative PCR experiment. With the technical hurdle solved, specific formulations based on designs parameters for plasmid DNA were characterized for their size, shape, surface charge, nuclease protection and ability to transfect different cell lines and produce non-toxic target specific knockdown. In contrast to plasmid DNA, nanoparticles formed with siRNA were all spherical, and their size ranged from 40-100 nm. For the first time, nanoparticles could be obtained at low N:P ratio in striking difference with the literature. Nuclease protection was found to be molecular weight dependent, and gene silencing in the presence of 10 % serum reached around 80%. This study demonstrated that nanoparticles formulated at low N:P ratio were able to form stable nanoparticles and induce target knockdown. In an attempt to understand the influence of chitosan molecular weight and degree of deacetylation on in vitro transfection efficiency, toxicity, genotoxicity, hemocompatibility and in vivo biodistribution, a library of precisely characterized chitosans was produced at different DDAs (98%, 92%, 80% and 72%) and Mn (5, 10, 40, 80 and 120 kDa). They were then mixed with siRNA at N:P ratios of 5:1 and 30:1, and nanoparticles were characterized for their size and surface charge in the presence of 10 and 150 mM salt. Encapsulation (EE) and transfection efficiencies were characterized at pH 6.5 and 8 for EE and pH 6.5 and 7.4 for in vitro transfection. Formulations were selected for further characterization of the influence of Mn and N:P ratio on nanoparticle uptake, metabolic activity, genotoxicity, and in vitro transfection in the presence of increasing concentrations of serum. Hemocompatibility and in vivo biodistribution were also investigated for several Mn, N:P ratio, and dose. Nanoparticle uptake and gene silencing correlated positively with increased surface charge, which in turn was obtained at high DDA and high Mn. A minimum polymer length of ~60-70 monomers, or Mn of ~10kDa, was required for stability and in vitro knockdown in the presence or absence of serum. In vitro knockdown reached levels equivalent to the DharmaFECT® (~ 80-90%) with no metabolic toxicity or genotoxicity, the former in contrast to the lipid-based control which severely impaired metabolic activity. Serum had negative dose-dependent effects on biological performance, which correlated inversely with increased DDA, Mn and N:P. The poor in vitro performance above 50% serum concentration is believed to be multifactorial in cause and could not be elucidated. Despite the negative effect of serum on in vitro transfection efficiency, several reports have demonstrated in vivo efficacy. Hemocompatibility was found to be dose-dependent and increased with both Mn and DDA prompting the use of hyaluronic acid (HA), a biocompatible and negatively charged polymer, to coat nanoparticles for limited blood interaction and improved colloidal stability. Single ascending dose toxicity studies showed that uncoated chitosan-formulated at N:P 5 could be tolerated up to 2.5mg/kg siRNA dose, with nanoparticle coating improving tolerability by at least 4-folds. In contrast to commercially available, and liver-restricted lipid nanoparticles (LNPs), both uncoated and HA-coated did not induce pro-inflammatory cytokines such as. IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, and KC, nor had obvious effects on the liver (ALT, AST, ALP) and kidney (BUN, Creatinine) biomarkers. Thrombocytopenia was only observed with the LNPs formulated with a native siRNA sequence confirming previous reports and highlighting differences with chitosan. Repeated administration and histopathological analysis confirmed the safety profile of chitosan versus LNPs. In vivo biodistribution in mice showed accumulation of nanoparticles in the proximal epithelial tubules of the kidney, where 40-50% functional knockdown was observed and confirmed using multiple techniques, suggesting potential applications in kidney diseases.