Développement d'un indicateur d'effet écotoxicologique terrestre pour le cuivre basé sur l'activité enzymatique

L'écotoxicité terrestre est une catégorie d'impact évaluée en analyse de cycle de vie (ACV) permettant de caractériser la toxicité des substances chimiques sur les organismes vivants. Cette catégorie d'impact utilise des données expérimentales tirées d'études scientifiques qui sont à ce jour peu nombreuses compte tenu de la nature hétérogène du sol, par opposition à l'écotoxicité aquatique dont les données expérimentales sont abondantes. C'est pour cette raison que des facteurs de conversion arbitraires ont été déterminés afin d'extraire des données d'écotoxicité terrestre à partir de l'écotoxicité aquatique. Malheureusement les relations utilisées en ACV pour convertir les données d'effet aquatiques en données d'effet terrestres ne sont pas fiables. Ainsi les différentes méthodes d'évaluation des impacts du cycle de vie (ÉICV) ne tiennent pas compte de la spéciation et de la biodisponibilité des métaux et ainsi surestiment la toxicité des métaux en n'évaluant que la forme totale du métal. L'impact modélisé à partir des modèles utilisés en ACV est donc inadéquat et peu représentatif de la réalité. De ce fait, IMPACT WORLD+, une nouvelle méthode d'ÉICV, a été développée afin d'inclure, dans le futur, des notions de spéciation, spatialisation intégrant la notion d'écotoxicité terrestre. La collecte des données expérimentales reste toujours un problème afin d'alimenter le modèle USEtox utilisé dans la nouvelle méthodologie pour l'écotoxicité. Les données générées jusqu'à présent, couvrent surtout les invertébrés du sol et la végétation alors que peu de données sont disponibles sur les micro-organismes qui sont pourtant garants de la santé des sols et directement exposés à la contamination métallique via le compartiment du sol. Afin d'évaluer l'activité microbienne, l'activité enzymatique (AE) semble être l'indicateur désigné, de par sa grande sensibilité à de fortes concentrations de Cu. L'invertase, l'uréase, la protéase, l'arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase sont des enzymes couvrant tous les cycles biogéochimiques du sol (azote, souffre, carbone et phosphore) et sont impliquées dans la croissance des plantes et la décomposition des composés organiques en sous-unités assimilables. Les enzymes du sol satisfont aux critères d'indicateur de choix quant à la mesure des effets d'une contamination métallique sur les fonctions de la communauté microbienne puisqu'ils fournissent une évaluation biochimique intégrée unique de l'état et du fonctionnement du sol. Les AE doivent être associées à des paramètres complémentaires, tels que la teneur en matière organique (MO) ou le pH, pour être utiles comme indicateurs de la santé des sols. L'hypothèse de ce projet de recherche est la suivante : l'évaluation de la toxicité du cuivre sur la diversité enzymatique pour plusieurs types de sol permet de développer un indicateur écotoxicologique terrestre global et ce indépendamment du pH et du contenu en matière organique des sols étudiés. En effet, des enzymes tels que l'invertase, l'uréase, la protéase, l'arylsulfatase, la phosphatase et la β-glucosidase couvrent plusieurs processus essentiels à la santé des sols et sont donc tout indiqués dans le développement d'un indicateur global. Les objectifs spécifiques sont de: 1) vérifier la méthodologie développée par Lessard et al. (2014) pour le cuivre ; 2) obtenir des EC50 expérimentalement pour le cuivre pour un phyla peu couvert par la littérature, les micro-organismes, pour des sols présentant une grande variabilité physico-chimique et les agréger afin d'obtenir un indicateur unique ; 3) vérifier l'influence de la variabilité des propriétés physico-chimiques sur la spéciation du cuivre et sa toxicité inhérente ; 4) renforcer les conclusions obtenues pour les 15 sols échantillonnés par une évaluation de la toxicité du Cu sur l'activité enzymatique pour des sols de vignoble ayant des propriétés physico-chimiques similaires. Quinze sols ont donc été échantillonnés afin d'être divisés en paire : une des deux paires a été contaminée au CuCl2 (sol contaminé), alors que l'autre paire a été amendée en CaCl2 (sol témoin) afin de venir balancer la teneur en ions chlorures dans les deux sols, ce qui a permis de les comparer. Les sols ont été lixiviés afin de reproduire des conditions de terrains. Les essais enzymatiques pour l'invertase, l'uréase, la protéase, l'arylsulfatase, la phosphatase et β-glucosidase ont ensuite été menés dans de l'eau déionisée afin de respecter le pH naturel du sol. En parallèle, la caractérisation physico-chimique des sols a été effectuée, soit l'analyse de la concentration en Cu total et en Cu soluble, la mesure du pH, de la COT, de la COD, de la CEC et de la capacité tampon. Les résultats obtenus ont été traités statistiquement par le biais de tests de « Student » appariés, d'ANOVA et de PCA afin d'obtenir des corrélations entre les activités enzymatiques, la concentration en Cu soluble et les caractéristiques physico-chimique des sols. Le rapport entre l'activité enzymatique mesurée dans le sol contaminé et celle mesurée dans le sol témoin a permis de dégager des pourcentages d'activité enzymatique (% AE). Ces %AE ont été tracés en fonction de la concentration en Cu soluble pour les sols dont les concentrations en produit (suite aux essais enzymatiques) étaient significativement différentes pour une même paire. Le modèle hyperbolique d'inhibition partielle a été ajusté aux résultats puisqu'il semblait être le plus adapté dans le cadre de ce projet. Parce que les 15 paires de sol présentaient une grande variabilité physico-chimique, il n'a pas été possible d'extraire un indicateur unique basé sur les EC50 qui auraient pu être obtenues pour chaque enzyme. En effet, la seule enzyme pour laquelle il a été possible d'obtenir une EC50 est la β-glucosidase (1,2 mg Cu soluble/ kg de sol sec) et ce pour seulement six paires de sols dont les pH étaient similaires (pH entre 7,28 et 7,71 sauf pour le sol A à pH 5,01). Les concentrations en Cu soluble et en Cu total n'était que très peu corrélées aux différentes activités enzymatiques, tandis qu'on l'on a pu observer une forte influence des propriétés physico-chimiques, notamment le pH et la MO, sur la distribution du Cu et sur les activités enzymatiques. Ce sont des variables qui impactent grandement la toxicité du Cu et doivent être prises en compte lors de l'évaluation de l'effet de celui-ci, ce qui expliquerait la difficulté d'extraire des données pour des sols présentant autant de disparités au niveau de leurs propriétés. Ainsi, les sols de vignoble, présentant des propriétés semblables ont permis de dégager une tendance similaire au niveau de l'effet sur les six enzymes sauf pour l'arylsulfatase. Le nombre de données étant insuffisant pour ajuster des courbes de tendance, il serait intéressant de pousser plus loin, soit en évaluant l'activité enzymatique pour des sols strictement similaires au niveau des caractéristiques physico-chimiques pour différentes concentrations de Cu ou extraire des EC50 pour le même sol à différentes concentrations de Cu et ce pour plusieurs sols afin de comparer les EC50 entre elles et de vérifier si l'on peut grouper les sols selon des archétypes. En conclusion, l'extraction d'un indicateur global d'écotoxicité terrestre du Cu n'a pas été possible dans le cadre de cette étude. Ainsi, il est recommandé d'utiliser une méthodologie considérant la concentration totale en fonction des archétypes de sol, des caractéristiques physico-chimiques et de la végétation environnante. L'évaluation du risque environnemental ne devrait pas se faire seulement sur la base des indicateurs sans tenir compte des conditions dans lesquelles ces indicateurs ont été obtenus. Beaucoup de paramètres physico-chimique ont un double rôle ce qui rend la prédiction de la réponse toxique très complexe. Une autre avenue intéressante serait d'évaluer la spéciation du Cu afin de voir quelle fraction serait la plus représentative de l'effet toxique du Cu sur les enzymes.

Abstract

Terrestrial ecotoxicity is an impact category assessed in life cycle analysis (LCA) to characterize the toxicity of chemicals to living organisms. This category of impact uses experimental data from scarce scientific studies, due to the heterogeneous nature of the soil. Conversely, aquatic ecotoxicity data is abundant. For this reason, arbitrary conversion factors have been determined to convert terrestrial ecotoxicity data from aquatic ecotoxicity. Unfortunately, the relationships used in LCA to convert aquatic effect data to terrestrial effect data are unreliable. Thus, the various life cycle impact assessment (LCIA) methods do not take into account the speciation and bioavailability of metals. Notably, they overestimate the toxicity of metals by evaluating only the total fraction of the metal. The impacts predicted with LCA is therefore inadequate and not representative of reality. As a result, IMPACT WORLD +, a new LCIA method, has been developed to include, in the near future, notions of speciation, spatialization and terrestrial ecotoxicity. Collecting experimental data is crucial to feed the USEtox model used in the new methodology for ecotoxicity. The data generated so far mainly cover soil invertebrates and vegetation. Unfortunately, little emphasis has been put on microorganisms, which are responsible for soil health and are directly exposed to metal contamination via the soil compartment. In order to evaluate microbial activity, enzymatic activity (EA) appears to be the designated indicator, due to its high sensitivity to high concentrations of Cu. Invertase, urease, protease, arylsulfatase, phosphatase and β-glucosidase are enzymes covering all soil biogeochemical cycles (nitrogen, sulfur, carbon and phosphorus) and are involved in the growth of plants and the decomposition of organic compounds into assimilable subunits. Soil enzymes meet the choice indicator criteria for measuring the effects of metal contamination on microbial community functions. Indeed, they provide a unique integrated biochemical assessment of soil condition and function. EAs must be associated with additional parameters, such as organic matter (OM) or pH, to be valid indicators of soil health. This project is based on the premise that the evaluation of the toxicity of copper on the enzymatic diversity for several types of soil allow developing a global terrestrial ecotoxicological indicator. The latter would be independent of the pH and the organic matter content of the soils studied. Invertase, urease, protease, arylsulfatase, phosphatase and β-glucosidase are enzymes covering several processes essential to soil health and are therefore well suited to the development of a global indicator. The specific objectives are: 1) Verifying the methodology developed by Lessard et al. (2014) for copper; 2) Obtaining EC50 experimentally for copper for a phyla little covered by the literature, microorganisms, for soils with high physicochemical variability and aggregate them in order to obtain a single indicator; 3) Verifying the influence of variability of physico-chemical properties on copper speciation and its inherent toxicity; 4) Reinforcing the conclusions obtained for the 15 soils sampled by an evaluation of the Cu toxicity on the enzyme activity for vineyard soils with similar physicochemical properties. Fifteen soils were sampled in order to be divided into pairs: one of the two pairs was contaminated with CuCl2 (contaminated soil), while the other pair was amended in CaCl2 (control soil) in order to balance the chloride ions in the two soils. This enables a meaningful comparison between the two soils. Soils have been leached to reproduce field conditions. The enzymatic tests for invertase, urease, protease, arylsulfatase, phosphatase and β-glucosidase were then carried out in deionized water in order to maintain the natural pH of the soil. In parallel, physicochemical characterization of the soils was undertaken: analysis of total Cu and soluble Cu concentration, pH, TOC, COD, CEC and buffer capacity. The results were statistically analyzed by paired "Student" tests, ANOVA and PCA in order to obtain correlations between enzymatic activities, soluble Cu concentration and soil physicochemical characteristics. The ratio between the enzymatic activity measured in the contaminated soil and the measured one in the control soil made it possible to obtain percentages of enzymatic activity (%AE). These % EAs were plotted as a function of the Cu soluble concentration for the soils which product concentrations (following enzymatic tests) were significantly different for the same pair. The hyperbolic model of partial inhibition was adjusted to the results since it appeared to be the most suitable for this project. Because soil pairs exhibited high physico-chemical variability, it was not possible to extract a single indicator based on the EC50s that could have been obtained for each enzyme. Indeed, the only enzyme for which it was possible to obtain an EC50 is β-glucosidase (1.2 mg soluble Cu / kg dry soil) and this for only six pairs of soils with similar pH (pH between 7.28 and 7.71 except for soil A at pH 5.01). The concentrations of soluble Cu and total Cu were slightly correlated with the different enzymatic activities. Conversely, a strong influence of physicochemical properties, especially pH and OM, on the distribution of Cu and on enzymatic activities is reported. These variables greatly impact the toxicity of Cu and should be taken into account when evaluating the effect of Cu. This explains the difficulty of extracting data for soils with so various properties. Thus, vineyard soils with similar properties revealed a similar trend in the effect on the six enzymes except for arylsulfatase. Since the data is insufficient to adjust trend curves, it would be worthwhile going forward in two potential directions. The first one is evaluating the enzymatic activity for soils that have identical physicochemical characteristics for different concentrations of Cu. The second is extracting EC50 for the same soil at different concentrations of Cu, repeating this for several soils and comparing the EC50 between one another to verify if one can gather the soils with respect to archetypes. In conclusion, the extraction of a global indicator for terrestrial ecotoxicity of Cu was not possible in this study. Thus, it is recommended to use a methodology considering the total concentration according to soil archetypes and physicochemical characteristics but also to take into account the surrounding vegetation. The environmental risk assessment should not only consider the indicators but also the conditions under which these indicators have been obtained. Many physicochemical parameters have a dual role which makes the prediction of the toxic response very complex. Another interesting road is the evaluation of the Cu speciation in order to see which fraction would be most representative of the toxic effect of Cu on the enzymes.