Transformation régiosélective du chitosane par thioacétylation pour applications biomédicales

Depuis le séquençage du génome, la thérapie génique est devenue une approche de traitement potentielle pour un vaste éventail de pathologies, jusqu'alors considérées comme incurables. Ce procédé consiste en l'introduction de matériel génétique sous la forme d'acide nucléique (AN) chez un patient, afin d'insérer un allèle fonctionnel des gènes déficients responsables de sa maladie, voire de modifier l'expression du ou des gènes délétères impliqués dans sa pathologie. En théorie, après leur administration les ANs doivent pénétrer dans la circulation sanguine et rentrer à l'intérieur des cellules du tissus désiré afin d'y exercer leur activité thérapeutique. Dans la pratique, l'administration d'ANs n'est pas si aisée car ces macromolécules polyanioniques sont extrêmement sensibles aux enzymes contenues dans le plasma sanguin et leurs charges négatives limitent leur passage au travers des membranes biologiques. Ainsi, l'utilisation de transporteurs ou vecteurs s'est avérée nécessaire pour protéger les ANs dans la circulation et de leur permettre de traverser les barrières cellulaires. Au sein de notre laboratoire (Biomaterials and Cartilage Laboratory, Polytechnique Montréal), le chitosane (CS) qui est un polymère naturel a été choisi en tant que vecteur d'ANs pour sa biocompatibilité et ses caractères biodégradables et non-toxiques. Le CS, en tant que polymère cationique, se complexe avec l'AN via interactions électrostatiques pour former des polyplexes. Ces polyplexes portent une charge globale positive, ce qui leur permet dans des conditions in vitro, de conserver une stabilité colloïdale, de passer facilement les membranes cellulaires, de pouvoir sortir de l'endosome et de libérer le matériel génétique dans le cytoplasme. Cependant, lors de leur administration in vivo, les polyplexes sont soumis au pH sanguin (pH 7.4), aux fortes concentrations en sels (150 mM) et à l'adsorption des protéines plasmatiques (PPL). Il en résulte une agglomération irréversible de ces nanostructures, suivie de leur reconnaissance accrue par le système réticulo-endothélial résultant à leur élimination prématurée de la circulation sans pouvoir y exercer un effet thérapeutique. Une solution pour augmenter la demi-vie des polyplexes CS-AN in vivo est d'y ajouter un bouclier hydratant sur la surface, à savoir une couche de poly(éthylène glycol) (PEG). Le PEG en tant que polymère extrêmement hydrophile et non-interpénétrant, aura ainsi la capacité d'assurer une stabilité colloïdale aux polyplexes, de limiter l'adsorption des PPL sur leur surface et donc de prolonger leur temps de circulation dans l'organisme. Parmi les stratégies de PEGylation de polyplexes existantes, notre choix s'est porté sur la formation de structures interpolyélectrolytes ayant un comportement micellaire, les « Block ionomer complexes » (BICs). Les BICs seraient formés par auto-assemblage via la complexation d'ANs et de copolymère en bloc CS-b-PEG, le cœur des particules devenant ainsi hydrophobe entouré d'une couche protectrice de PEG hydrophile. Une telle structure à base de CS n'a pas encore été proposée dans la littérature et permettrait d'ouvrir de nouvelles voies au CS en tant que système de livraison. De ce fait, l'objectif principal de ce projet de Doctorat est de former un copolymère en blocs CS¬b-PEG et de l'engager dans la formation de BICs. Les chimies de conjugaison de l'extrémité terminale du CS ont été rarement exploitées dans la littérature. Bien que le dernier monomère réducteur du CS offre une fonction aldéhyde par ouverture de cycle, la façon la plus aisée de générer des extrémités réactives de CS est de procéder à sa dépolymérisation à l'acide nitreux (HONO), produisant ainsi une unité 2,5-anhydro-D¬mannose (M-Unit), portant également une fonction aldéhyde. Cependant, la littérature suggère que cette fonction est majoritairement présente sous sa forme hydratée et non-réactive, dite gem-diol, en conditions aqueuses à faible pH. Dans des études similaires, la chimie click-oxime a été utilisée avec plus ou moins de succès afin de réagir avec de tels aldéhydes, mais l'addition d'un co-solvant ainsi que d'agents chimiques additionnels sont nécessaires à l'obtention d'une structure stable. Dans ce projet, la disponibilité de la forme réactive de l'aldéhyde terminal du CS traité au HONO ainsi que sa réactivité envers les thiols en conditions acides ont été évaluées. En effet, ces conditions (aqueuses à faible pH) sont nécessaires à la solubilisation du CS de par la protonation de ses amines; ses dernières étant chargées, elles ne seront donc pas réactives envers l'aldéhyde terminal porté par la M-Unit. Dans ces conditions, le choix des thiols s'est imposé de par leur plus haute réactivité envers les carbonyles que leurs homologues hydroxyles ou amines. Des études de spectrométrie de masse (LC-MS) et de résonance magnétique nucléaire (1H et DOSY NMR) ont confirmé la thioacetylation régiosélective de l'aldéhyde terminal du CS avec des taux de conversion variant de 55 à 70% dépendamment de la molécule engagée. Il a également été démontré que la stabilisation de l'intermédiaire hémithioacétal en thioacétal est facilitée en lyophilisant le milieu réactionnel. En tant qu'application directe de cette nouvelle chimie de conjugaison, la PEGylation en bout de chaine du CS a été effectuée avec succès par thioacetylation. Les copolymères, notés CS-b-PEG2, ont ensuite été engagés avec de l'ADN plasmidique pour former des polyplexes ayant une structure micellaire. En effet, des images de microscopie électronique ont révélé que les nanoparticules obtenues ont une morphologie uniformément sphérique alors qu'un mélange de bâtonnets/torroïdes/sphères est en général obtenu avec du CS non-modifié. En dépit du fait que l'objectif principal de ce projet ait été atteint à ce niveau, le procédé de thioacétylation régiosélective décrit ci-dessus demeure incompatible avec l'introduction de groupements sensibles à l'hydrolyse acide et son efficacité est limitée par l'encombrement stérique occasionné par le fait que deux attaques de thiols successives au même endroit sont nécessaires à l'obtention d'une structure stable, le thioacétal. De plus, la purification des CS PEGylés s'est avérée extrêmement difficile, notamment à cause de la polydispersité du CS utilisé dans la réaction. Nous avons alors développé une autre approche de modification régiosélective de l'extrémité du CS par thioacétylation, impliquant la conjugaison d'un linker portant trois fonctions thiols. Ce linker trivalent, le Triskelion, a été conçu pour activer le mannose terminal du CS (M-Unit) par une de ses deux extrémités portant un crochet-thiol au travers d'un mécanisme intramoléculaire. Son extrémité thiol restante, situé au bout d'un espaceur, sera engagée a posteriori avec d'autres espèces réactives aux thiols. La synthèse en trois étapes du Triskelion a été effectuée avec succès et sa réactivité avec la M-Unit a été étudiée de manière semi-quantitative par LC-MS, révélant la prédominance d'un mécanisme de thioacétylation intramoléculaire (89%). Cette dérivatisation régiosélective a également été accomplie sur l'aldéhyde terminal de chaines de CS avec plus de 85% d'efficacité, tel que confirmé par spectroscopie RMN (1H et DOSY). En tant qu'application finale de ce nouveau procédé, la réactivité de l'extrémité thiol des conjugués CS-b-Triskelion a été démontrée par leur conjugaison chimiosélective sur la surface de billes magnétiques, par déplacement de ponts disulfures avec 50% d'efficacité. La thioacétylation et plus particulièrement l'activation terminale du CS avec le Triskelion ouvrent de nouvelles perspectives dans le domaine des applications biomédicales, spécialement au niveau des modifications de surfaces et autres formations de copolymères au travers de la formation de liens labiles et/ou non-labiles.