Façonnage de la surface de nanoparticules pour la délivrance de gènes

La vectorisation de gènes est devenue un outil incontournable dans les nouvelles biotechnologies. Elle est également au coeur de la recherche et du développement de thérapies géniques, qui visent à introduire du matériel génétique dans le noyau de cellules ciblées. L'ADN à transporter étant fragile, la plupart des techniques de vectorisation se fondent sur l'emploi de nanoobjets capables d'encapsuler et de protéger cet ADN. Ils permettent également le transport du gène jusqu'au noyau des cellules visées pour en permettre l'expression. Ces nanovecteurs sont formés à partir de divers matériaux, incluant des polymères. En particulier, les polyplexes sont des nanovecteurs issus de la complexation entre de l'ADN et un polymère chargé positivement. Les travaux présentés ici consistent à approfondir le rôle de l'interface entre un modèle de polyplexe et l'environnement physiologique et cellulaire avec lesquels il va interagir lors du processus de délivrance de gènes ou transfection. En particulier, dans le cadre de la lutte contre le cancer, la délivrance systémique est envisagée afin de permettre aux polyplexes de s'accumuler dans le tissu tumoral, ainsi que ses éventuelles métastases. L'enjeu est donc double : Il s'agit de doter les polyplexes de ligands leur permettant de cibler les cellules cancéreuses afin de livrer le gène au bon endroit ; et également d'un revêtement de surface les rendant capables de circuler sans encombre dans le sang tout en limitant leur élimination par le système des phagocytes mononucléés. Dans une première étude, nous avons mis en place un système d'accroche de ligands à la surface de polyplexes. Nous nous sommes basés sur le tandem de peptides E/Kcoil : deux peptides permettent un attachement stable, orienté et spécifique entre deux entités par auto-assemblage en solution. D'un côté, nous avons choisi un ligand : le facteur de croissance épidermique étiqueté avec le peptide Ecoil par ingénierie moléculaire (Ecoil-EGF) ; et de l'autre côté, un polyplexe décoré avec le peptide complémentaire Kcoil a été mis au point. Pour ce faire, un polymère cationique – le polyéthylènimine branché (bPEI) – a été fonctionnalisé avec une petite molécule réactive vers le peptide Kcoil. Les polyplexes formés avec ce PEI activé ont pu être décorés en surface en y greffant le peptide Kcoil. Ce système nous a permis d'étudier finement l'influence de la densité de ligand en surface du polyplexe par rapport à leur absorption par des cellules cancéreuses A431 sur-exprimant le récepteur de l'EGF (EGFR). Nous avons ainsi mis en évidence un effet de palier reliant le taux d'internalisation des polyplexes par les cellules A431 via l'interaction EGF/EGFR et la quantité de ligands sur les polyplexes. Ensuite, une deuxième étude a été menée au sujet de l'enrobage électrostatique de polyplexes au moyen de dextrane carboxyméthylé (CMD). Ici l'objectif était de dégager des relations entre la structure du revêtement – la densité de charge et le poids moléculaire du CMD utilisé – et sa fonction vis-à-vis de l'environnement physiologique. Nous avons préparé et caractérisé une chimiothèque de 26 CMD en opérant la carboxyméthylation contrôlée de 4 dextranes de poids moléculaires différents. Un protocole de revêtement électrostatique simple et robuste a été mis en place afin de mener une étude systématique de l'ensemble de la chimiothèque. Chaque formulation de polyplexes enrobés a été testée vis-à-vis de constituants du milieu physiologique découplés les uns des autres : petits ions, DNases, protéines du plasma, globules rouges, et cellules ciblées. Nous avons observé des tendances monotones entre chacun des deux paramètres et l'encapsulation de l'ADN. À notre grande surprise, ces observations n'ont pas été corrélées avec la protection de l'ADN contre la dégradation par les DNases, cette dernière se révélant corrélée à l'expression de gènes par les cellules ciblées.

Abstract

Gene vectorization has become an essential tool in the field of biotechnology. It is also found at the heart of research and development of gene therapies, a specific goal of which is to deliver genetic material in the nuclei of target cells. As the DNA to be delivered is fragile, most vectorization techniques include the use of nanoobjects that are able to encapsulate and protect this delicate cargo. These nanoobjects also facilitate gene transport to the nuclei of target cells whereby its expression can occur. These nanovectors are made from varied materials that include polymers. Particularly, polyplexes form a class of nanovectors that derive from the complexation between DNA and a positively charged polymer. The works presented here are focused on the role of the interface between a model polyplex and the surrounding cellular and physiological environments during the process of gene delivery or transfection. More specifically, in the framework of oncology, systemic delivery has been investigated to enable polyplex accumulation in tumor tissue as well as in ensuing metastases. The stakes are twofold here: it is relevant to decorate polyplexes both with ligands that enable the specific targeting of cancer cells in order to deliver genes at the right place and with a complete surface coating enabling them to circulate more freely in the bloodstream while limiting their elimination by the mononuclear phagocyte system. In a first study, we set up a system to tether ligands at the surface of polyplexes. We based our works on the E/Kcoil tandem: two peptides that enable a stable, oriented and specific tethering between two entities by auto assembly in solution. On the one side, we chose a ligand: a chimeric protein corresponding to the Ecoil peptide fused with the epidermal growth factor (Ecoil-EGF); and on the other side, we engineered a Kcoil peptide-decorated polyplex. In that endeavor, a cationic polymer – branched polyethylenimine (bPEI) – was functionalized with a moiety reactive to the Kcoil peptide. Polyplexes prepared with this activated bPEI could then be decorated at their surface by the covalent grafting of Kcoil. This system enabled us to fine-tune the ligand surface density in order to study its influence on polyplex uptake by cancer-derived EGF receptor (EGFR)-over-expressing A431 cells. Thus, we evidenced a switch effect between the EGFR-specific polyplex uptake rate by A431 cells and the amount of ligand on polyplexes. Then, we carried out a second study that was focused on the electrostatic coating of polyplexes with carboxymethylated dextran (CMD). The objective was to draw relations between the coating structure – defined by the charge density and the molecular weight of the CMD used – and its function relative to the biological environment. We prepared and characterized a chemical library of 26 closely related CMDs by the controlled carboxymethylation of 4 dextrans differing by their molecular weight. A simple and robust electrostatic coating procedure was set up in order to carry out a systematic study of the CMD library. Each coated polyplex formulation was tested on decoupled relevant constituents of the physiological milieu: small ions, DNases, plasma proteins, red blood cells, and target cells. We observed monotonic trends between both parameters and DNA encapsulation. To our great surprise, those observations did not correlate with DNA protection against DNase challenging, the latter correlating with target cells reporter gene expression. Polyplex stability was evaluated at physiological salt concentration; the results of which indicated that both studied parameters had a jointed influence in preventing polyplex aggregation. At the surface of polyplexes, this influence translated in terms of steric and lateral stabilization rather than in terms of surface charge (zeta potential).