Modélisation dynamique de cultures de cellules CHO produisant un anticorps monoclonal en mode cuvée-alimentée

La production d'anticorps monoclonaux par culture de cellules de mammifères est une technologie désormais établie industriellement qui a évolué énormément au cours des dernières décennies. En progressant par expérimentation et par intuition, des améliorations importantes ont été accomplies concernant la productivité des cultures et la croissance des cellules CHO, mais les niveaux de productivité et de reproductibilité sont variables d'un bioprocédé à l'autre. En parallèle, de nombreux travaux ont été consacrés à l'étude du métabolisme de ces cellules afin d'en relever les réactions limitantes et ainsi d'optimiser les conditions de culture. En combinant à la fois ces connaissances sur le métabolisme et les résultats observés en bioréacteurs, il a été possible d'optimiser les stratégies d'alimentation et ainsi d'optimiser la composition du milieu de culture en cours de culture, en mode cuvée-alimentée. Ces travaux ont généralement fait appel à une série de cycles d'essais/erreurs guidés par l'intuition ainsi que par des plans expérimentaux très lourds à mettre en oeuvre. Toutefois, l'analyse du métabolisme cellulaire et l'optimisation d'un procédé nécessitent idéalement des outils qui sont à la fois descriptifs et prédictifs, permettant aussi bien d'analyser les résultats expérimentaux que d'explorer des pistes de solution quant à l'optimisation du bioprocédé. C'est dans cette optique de développement d'un modèle mathématique qui satisfait à ces conditions que s'inscrit ce mémoire. Dans le corps de ce travail, un modèle dynamique du métabolisme de cellules CHO est présenté et analysé. Ce modèle utilise comme entrées uniquement les conditions initiales d'une culture, c'est-à-dire les concentrations initiales extracellulaires et intracellulaires en nutriments et métabolites, afin de simuler les profils de concentrations de ces composés (intracellulaires et extracellulaires), en plus de la concentration cellulaire et la production d'anticorps dans le temps. Un tel modèle dynamique devrait également permettre de simuler les nombreux flux métaboliques en jeu. Le modèle est basé sur la description des flux métaboliques par des équations représentant des mécanismes biochimiques connus et sur la stoechiométrie du métabolisme central du carbone, incluant la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques, la voie des pentoses phosphates, le métabolisme des acides aminés) et du métabolisme énergétique de la cellule. Le modèle a été adapté à partir de travaux précédents de modélisation du métabolisme d'une autre lignée de cellules CHO, et a été construit de manière à pouvoir simuler efficacement le métabolisme face à des perturbations du milieu extracellulaire, particulièrement v par rapport à des variations de compositions du milieu initial et par rapport à l'application de différentes stratégies d'alimentation en cours de culture (i.e. mode cuvée-alimentée). Afin d'assurer la robustesse de la structure (i.e. réseau métabolique) du modèle ainsi qu'une estimation adéquate des valeurs des paramètres cinétiques, le modèle a été calibré à partir de quatre cultures en bioréacteurs. Ces cultures ont été effectuées en utilisant deux milieux différents, une culture en mode cuvée et une culture en mode cuvée alimentée pour chaque milieu. Une analyse de sensibilité a été effectuée pour identifier les 20 paramètres les plus sensibles du modèle et les valeurs de ceux-ci ont été optimisées de manière à réduire l'écart entre les simulations et les valeurs expérimentales. Cet exercice a de plus permis de localiser les voies métaboliques où oeuvrent les paramètres les plus importants. L'exercice d'optimisation a été effectué en utilisant l'ensemble des cultures réalisées, puis a été répété en utilisant différents sous-ensembles de paramètres, soit : seulement les cultures en mode cuvée, seulement les cultures en mode cuvée alimentée, ainsi que selon le milieu de culture utilisé. La comparaison des valeurs de paramètres obtenues et leur intervalle de confiance (95 %) a permis de déterminer qu'un seul ensemble de paramètres est suffisant pour décrire les cultures de CHO indépendamment du mode de culture ou du milieu de culture utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque l'on a comparé l'erreur globale de simulation des quatre cultures, soit en divisant ces dernières en deux phases successives (phase exponentielle, puis plateau) et en utilisant d'un seul bloc l'ensemble de chacune des cultures sans changement de paramètres. En outre, l'analyse des flux métaboliques effectuée, par simulations, a permis de constater que le métabolisme cellulaire est généralement très robuste et est peu affecté par les perturbations extérieures testées ici. Ces résultats permettent de confirmer l'applicabilité du modèle pour comparer différents types de milieux de culture et de stratégies d'alimentation. Le modèle proposé dans le cadre de ce mémoire de maîtrise est donc utile puisqu'il permet de prédire le comportement de cellules CHO selon différentes stratégies de cultures, ouvrant la voie pour des applications utiles à la planification d'expérience et à l'optimisation de bioprocédés de production.

Abstract

The production of monoclonal antibody (mAb) by mammalian cell culture is now a well established technology, after decades of intensive research. Significant improvements have been achieved through experimentation at all bioreactor scales, mainly based on intuition, enabling current production bioprocesses reaching high productivity while maintaining high cell concentration for extended time. Indeed, a significant amount of work has been made studying and describing CHO cell metabolism, identifying metabolic traits associated to culture behaviour. Combining these knowledge on cell metabolism and from bioreactor cultures, it was possible to optimize culture media composition as well as bioreactor culture feeding strategies. However, bioprocess productivity and reproductivity level vary among biosystems. Indeed, an efficient analysis of cell metabolism and process optimization require tools that can be descriptive and predictive, proposing optimized solutions and analyzing experimental results . With that in mind, the present masters thesis' aim was to propose a mathematical model that satisfies those criteria. A dynamic model of CHO cells metabolism is thus presented in this thesis, calibrated, analyzed and challenged with experimental data. The model, having as only input the culture initial conditions such as the extracellular and intracellular concentrations of nutrients and metabolites, simulates the concentration profiles of metabolites (intracellular and extracellular), cell growth, antibody production as well as metabolic flux dynamics. The model includes the kinetic description of the metabolic flux rates by equations derived from known biochemical mechanisms, and mass balances based on the stoichiometry of the cell's central carbon metabolism including glycolysis, TCA cycle, pentose phosphate pathway amino acid metabolism, mAb synthesis and energetic metabolism. The model presented here represents a further development from previous work on the modeling of another CHO cell line. It is specifically designed to simulate the effect of environmental disturbances such as variations of the initial medium compositions and of nutrients feeding strategies. In order to fine-tune the model structure as well as the values of the kinetic parameters, the model was calibrated on four different bioreactor cultures. Batch and fed-batch cultures were performed using two different media. A sensitivity analysis was performed on model parameters of which 20 were identified as the most sensitive ones, which values have been optimized to minimize the simulation error with respect to experimental data. This was also helpful to identify the metabolic vii pathways affected by the most sensitive parameters. The model parameter values optimization step was performed following various strategies: using experimental data of all cultures, and distinct data subsets such as batch or fed-batch cultures only, and for each culture media. Studying confidence intervals (95%) of model parameter values determined from each data sets, we show that a limited set of model parameters could describe CHO cultures irrespectively to the medium composition or the batch and fed-batch strategy. Similar conclusion can be drawn dividing the culture into exponential growth and plateau phases, estimating distinct parameter values in each phase, versus a model that simulates the entire culture without any parameters change. The resulting model was then used to perform a dynamic metabolic flux analysis, which revealed that the metabolism of the recombinant CHO cell line in this study is highly robust and highly regulated; the external perturbations having little effect on flux distribution. This work thus confirms the applicability of the dynamic model as an in silico platform to study different types of culture media and medium feeding strategies. The model could be used to help plan experiments or to optimize culture process.