Évaluation de l'efficacité des nanoparticules chitosane-siARN à inhiber, in vitro, l'expression du gène MDR1 responsable de la résistance à la chimiothérapie

Depuis la découverte de la Moutarde azotée, premier agent anticancéreux, la chimiothérapie occupe une place importante dans le traitement de plusieurs types de cancer. Malgré le progrès et l'avènement des médicaments anticancéreux, la chimiothérapie est souvent limitée par des mécanismes de résistance développés par les cellules cancéreuses. Parmi les mécanismes les plus répandus est l'expulsion des médicaments anticancéreux à l'extérieur des cellules. Ceci aboutit à une diminution de la concentration intracellulaire du médicament affectant ainsi son activité anti tumoral. L'expulsion des médicaments anticancéreux est causée par la surexpression des protéines membranaires dont la plus connue est la glycoprotéine P (Pgp). L'hydrolyse de l'ATP par cette protéine fournit de l'énergie nécessaire pour assurer un transport actif à travers la membrane plasmique de plusieurs types de molécules anticancéreuses indépendamment de leur structure. Codée par le gène MDR1, la surexpression de la Pgp est détectée chez plus que 50% des patientes atteintes de cancer du sein. Contrairement aux inhibiteurs chimiques, les petits ARN interférents (MDR1-siRNA) sont capables d'inhiber plus spécifiquement la Pgp et contourner la chimiorésistance. Ces petits ARN doubles brins de 21 nucléotides peuvent lier spécifiquement la séquence d'ARN messager du gène MDR1 et engendrer sa dégradation inhibant ainsi la traduction de la Pgp. Cependant, l'efficacité des MDR1-siRNA est limitée par leur vulnérabilité dans le milieu physiologique et leur incapacité à franchir les barrières cellulaires. D'où la nécessité d'un système de livraison pour assurer le potentiel thérapeutique des MDR1-siRNA. Dans ce présent travail, le système de livraison utilisé est le chitosane, un polymère naturel, biodégradable et non toxique. Le chitosane est caractérisé par son degré de désacétylation (DDA), sa masse moléculaire (MM) et son ratio amine phosphate (N : P). Pour des fins de simplicités, ces paramètres sont décrits de la façon suivante [DDA-MM-N:P]. Étant donné sa charge cationique, le chitosane est capable d'interagir électrostatiquement avec les MDR1-siRNA et former des nanoparticules chitosane/MDR1-siRNA. La taille et la forme de nanoparticules a été évaluées par diffusion dynamique de la lumière et aussi par microscopie électronique à balayage (ESEM). La mesure du potentiel zêta caractérise la charge des nanoparticules chitosane/MDR1-siRNA. La formation des nanoparticules et leur stabilité en fonction du pH a été évaluées avec le recours au réactif RiboGreen et suite à une migration sur gel de polyacrylamide. La capacité des nanoparticules à

Abstract

Since the discovery of nitrogen mustard, the first anticancer agent, chemotherapy has palyed an important role in the treatment of several types of cancer. Despite the progress and the advencement of anti-cancer drugs, chemotherapy is often limited by resistance mechanisms developed by cancer cells. Among the most common mechanisms is the expulsion of anticancer drugs out of the cells, resulting in a decreased intracellular concentration and lowered antitumor activity. The expulsion of anticancer drugs is mediated by the over-expression of the transmembrane transport protein where the best characterized is P glycoprotein (Pgp). This protein utilize the energy of ATP to actively carry out structurally and functionally unrelated anticancer agents across the plasma membrane. Encoded by the MDR1 gene, the predominant role of Pgp is detected in more than 50 % of breast cancer patient. Unlike chemical inhibitors, small interfering RNAs (MDR1-siRNA) provide a more specific downregulation of Pgp and reversion of the drug resistance. These small double-stranded RNA (21 nucleotides) are able to bind to a specific mRNA sequence of the MDR1 gene, causing its degradation and thereby disabling translation of Pgp. However, the efficiency of MDR1-siRNA is limited by their vulnerability in the physiological medium and their inability to cross cell barriers. For this purpose, a delivery system is needed to potentiate the effect of siRNA. In this study, the delivery system used is chitosan, a natural, biodegradable and non-toxic polymer. Chitosan is characterized by its degree of deacetylation (DDA), molecular weight (MM) and amine to phosphate (N: P) ratio. For simplicity, these parameters are described as follows [DDA- MM- N:P]. Chitosan is able to interact electrostatically with the MDR1-siRNA due to its cationic charge, leading to chitosan/MDR1-siRNA nanoparticles. The nanoparticles size and morphology was evaluated by dynamic light diffusions (DLS) and scanning electron microscopy (ESEM). Nanoparticles surface charge was characterized by measuring the zeta potential. Furthermore, the formation of chitosan nanoparticles and their stability under variable pH was evaluated by RiboGreen and polyacrylamide gel electrophoresis. The nanoparticles ability to bypass cellular membrane was analyzed by confocal microscopy and flow cytometry (FACS). The efficacy of nanoparticles in gene silencing was assessed by quantitative RT-PCR, and confirmed at the phenotypic level by western blot analysis. Whereas, the toxicity profile of chitosan nanoparticles was evaluated using Alamar Blue proliferation assay.