Development of a Dynamic Model to Describe CHO cells Metabolic Network and Regulation

L'objectif principal de ce travail est de démontrer qu'une approche de modélisation dynamique peut être utile pour comprendre le comportement du métabolisme central du carbone des cellules CHO. La première partie de ce travail se concentre sur le développement d'un modèle dynamique de cellules CHO du métabolisme primaire. Ce travail a été inspiré par un modèle cinétique métabolique auparavant développé dans notre groupe pour décrire le métabolisme cellulaire primaire decellules de plante. Le modèle métabolique a été développé et calibré à l'aide de données obtenues au préalable par notre groupe dans des cultures de cellules CHO produisant un activateur du tissu plasminogène recombinant en bioréacteur. En plus des données de base, telles les concentrations en biomasse, en glucose, en lactate, en glutamine et en ammoniac, les concentrations intracellulaires de plusieurs nucléotides et la consommation d'oxygène par cellule étaient également disponibles. Le principal résultat de cette partie consiste en un modèle métabolique cinétique qui permet de décrire le comportement des voies métaboliques majeures dans les cellules CHO, c'est-à-dire la glycolyse, la voie des pentoses phosphate, le cycle des acides tricarboxyliques, la glutaminolyse ainsi que la respiration cellulaire. Le modèle possède 30 réactions et plus de 72 paramètres. Les simulations obtenues à l'aide du modèle permettent de décrire les données expérimentales, ce qui suggère que la structure proposée du modèle est en accord avec le fonctionnement biologique des cellules CHO. Le modèle a également été utilisé pour étudier l'effet qu'a l'induction par le butyrate de sodium sur une culture de cellules CHO, celui-ci étant un produit chimique couramment utilisé pour augmenter la production spécifique de protéines recombinantes. En considérant le nombre élevé de paramètres, l'adaptation du modèle a été minime, nécessitant le changement de seulement quelques paramètres, en accord avec les modifications de l'expression des gènes rapportées pour décrire l'effet du butyrate de sodium sur des cellules CHO. Bien que principalement spéculatifs tout en reposant sur des simulations du modèle, les résultats concordent avec les données ainsi qu'avec les hypothèses issues de la littérature concernant l'effet du butyrate de sodium sur le métabolisme des cellules CHO. vi Dans une seconde partie, la capacité descriptive du modèle a également été évaluée à l'aide de données provenant d'une autre lignée cellulaire CHO recombinante cultivée à des conditions de culture différentes. Le modèle a été testé pour simuler des cultures discontinues de différents clones d'une lignée de cellules CHO ayant été génétiquement modifiée pour posséder un système d'expression inductible utilisant le cumate comme agent inducteur et permettant la production d'anticorps monoclonaux anti-CD 20. Une lignée présentant unefaible production spécifique et une lignée possédant une plus haute production ont été comparées à la lignée parentale. De plus, il a été possible d'augmenter le nombre de métabolites extracellulaires et intracellulaires à l'étude. Il a été démontré que la structure du modèle permet à celui-ci de facilement s'adapter à une autre lignée cellulaire CHO et ses clones, en ne nécessitant encore une fois qu'un nombre limité de modifications au modèle, qui ont été interprétés et analysés comme caractéristiques de lignées cellulaires spécifiques. La portée du modèle a été étendue ici de manière à décrire aussi le métabolisme des acides aminés et de la production d'anticorps. Il comprend donc maintenant 35 réactions et 92 paramètres. Toutefois, une modification limitée, c'est-à-dire trois et cinq paramètres pour la lignée à faible production et celle à production élevée respectivement, a permis des simulations qui décrivent avec précision les différences sur le plan métaboliques liées à la variation clonale. En se fiant à nos résultats, il est clair que ce modèle dynamique peut être facilement adapté à l'ensemble des cultures existantes. Enfin, dans la troisième partie de la thèse, le comportement du modèle a été étudié tout en intégrant la régulation métabolique de la glycolyse. Le but de cette étude était d'évaluer dans quelle mesure notre modèle cinétique peut décrire l'effet d'une perturbation soudaine sur le comportement du métabolisme cellulaire, tout en ayant été calibré à l'aide des données de culture montrant une dynamique lente. Les mécanismes de régulation connus de la glycolyse des cellules de mammifères, tels que les mécanismes d'inhibition par rétroaction, par anticipation et les mécanismes d'activation par des métabolites glycolytiques et les variables énergétiques ont été intégrés dans le modèle. Une expérience in silico a été réalisée en ajoutant un stress hypoxique soudain, diminuant à 10% de saturation de l'air. Le modèle a ensuite été modifié pour inclure l'effet de sept fonctions de régulation, à savoir l'inhibition par anticipation ou par rétroaction et l'activation de métabolites de la glycolyse et l'activation par rétroaction de l'état vii énergétique de la cellule, dans la voie de la glycolyse avec un paramètre pour chaque cas. Fait intéressant, la structure du modèle avec la glycolyse régulée résulte à la simulation du passage d'un métabolisme de phosphorylation oxydative à un métabolisme de la glycolyse anaérobique, un résultat qui est en accord avec la littérature. Le modèle développé a ainsi montré une capacité prédictive. En conclusion, ce travail a abouti à un modèle dynamique décrivant le comportement du métabolisme des cellules CHO, et qui pourrait être utile comme outil in silico pour l'optimisation des bioprocédés.

Abstract

The main objective of the work was to demonstrate that a dynamic modelling approach can be useful to elucidate the behaviour of CHO cells' central carbon metabolism. The first part of this work focuses on the development of a dynamic model of CHO cells primary metabolism. This work was inspired by a previously developed kinetic metabolic model in our group to describe plant cell primary metabolism. The metabolic model was developed and calibrated using data previously obtained in our group from bioreactor cultures of CHO cells expressing recombinant t-PA. In addition to routine datasets, including the concentration of cells, glucose, lactate, glutamine and ammonia with time, intracellular concentrations of energetic nucleotides and cell specific oxygen consumption were also available. The main outcome of this part consists in a kinetic metabolic model that allows describing the behaviour of the major metabolic pathways, i.e. glycolysis, pentose phosphate pathway, TCA cycle, glutaminolysis as well as cell respiration, in CHO cells. The model has 30 metabolic reactions and 72 parameters. Model simulations were shown to agree with experimental data, which is suggesting that the proposed model structure copes with CHO cells' biology. The model was also used for studying the effect of inducing CHO cell culture by adding sodium butyrate, a widely used chemical to enhance recombinant protein production. Albeit the high number of parameters, limited model adaptation was required (i.e. the changing of only few parameters values), in agreement with gene expression modifications reported in literature, to describe the effect of sodium butyrate on CHO cells. Results from model simulations further supports our previous findings that butyrate treatment at mid exponential phase may induce a shift in cellular metabolism by increasing the efficiency of glucose utilization, with a greater fraction of this nutrient channeled through TCA cycle. Although mostly speculative while based on model simulations, the results agreed with data as well as common hypothesis found in literature of the effect of sodium butyrate on CHO cell metabolism. In a second part, the descriptive capacity of the model was further assessed using data from another recombinant CHO cell line under different culture conditions. The model was then challenged to simulate batch cultures for different clones of a CHO cell line genetically modified with an inducible expression system, called the cumate gene-switch, ix for the production of anti CD-20 monoclonal antibody. Low- and high-producer cell lines were compared to parental. The extra- and intra-cellular metabolites quantification was also included in the study. The model structure showed to be easily adaptable to another CHO cell line and its clones, by only requiring limited model modifications, which were interpreted and analysed as specific cell line characteristics. The model was extended here to also describe amino acids metabolism and recombinant monoclonal antibody production kinetics. It thus now includes 35 reactions and 92 parameters. However, limited modification, i.e. changing few parameters in both low-and high-producing clones, allowed simulations that accurately described metabolic variations related to clonal variation. Different patterns of metabolic flux distribution specially in highproducer clone was simulated by the model and the increased efficiency of cell metabolism, i.e. greater portion of glucose incorporated into the TCA as opposed to being converted to lactate, and up regulation of TCA cycle, has shown to be more induced by clonal variation than by recombinant protein induction. From our results, it is clear that such dynamic model can be readily adapted to existing culture datasets. Finally, in a third part of the thesis, model behaviour was studied while integrating metabolic regulation of glycolysis. The aim of that study was to evaluate to what extent our kinetic model can describe the effect of a sudden perturbation on cell metabolic behaviour, while having been calibrated using culture data showing slow dynamics. Regulatory mechanisms known to apply along the glycolysis pathway in mammalian cells, i.e. feedback and feedforward inhibition and activation regulatory mechanisms from glycolytic metabolites and energetic variables, were integrated in the model. An in silico experiment was performed adding a sudden hypoxic stress, decreasing oxygen level at 10% of air saturation. The model was then modified to include the effect of seven regulatory functions in glycolysis pathway with one parameter for each case. Interestingly, the model structure with a fully regulated glycolysis results in the simulation of a shift from an oxidative phosphorylation metabolism to an anaerobic glycolysis metabolism, a result that is in agreement with literature. The implemented model thus showed a predictive capacity. In conclusion, this work has led to a dynamic model describing CHO cell metabolic behaviour that could be useful as an in silico tool for bioprocess optimization.