Optimisation de la croissance de cellules HEK293 exprimant la pyruvate carboxylase dans un bioréacteur en mode cuvée-alimentée

La demande pour les produits biopharmaceutiques ne cesse d'augmenter. Le processus de développement des bioprocédés se doit d'être rapide afin de pouvoir procéder rapidement aux essais cliniques dans le domaine. De plus, les coûts de production doivent être suffisamment bas pour permettre un coût raisonnable de vente. La majorité des molécules biologiques sont actuellement produites dans des cellules mammifères. Ces cellules sont toutefois caractérisées par un métabolisme lent, de faibles densités cellulaires atteintes en culture et conduisent à des concentrations en produit de l'ordre de quelques grammes par litre dans les meilleurs cas. Les cellules HEK293 sont une plateforme de production avantageuse de par leur origine humaine qui leur permet d'exprimer des protéines recombinantes comportant des modifications post-traductionnelles très similaires à celles présentes chez l'homme. La culture en mode cuvée est limitée par la quantité de nutriments disponible ce qui mène à de faible concentration finales en produit d'intérêt. La cuvée-alimentée est le mode de culture dominant dans l'industrie biopharmaceutique, car il est simple, flexible et la mise à l'échelle en est relativement aisée. Ce mode consiste à procéder à des ajouts en cours de culture de façon à maintenir des concentrations non limitantes de nutriments dans le milieu de culture, ce qui a généralement pour effet d'augmenter la durée des cultures et la concentration finale de produit. Par contre, cela entraîne invariablement l'accumulation de déchets métaboliques, qui constituent généralement le frein principal des cultures en mode cuvée-alimentée. Par le biais de l'ingénierie cellulaire, la production de ces métabolites néfastes peut toutefois être réduite en manipulant les voies métaboliques. Ainsi, des cellules HEK293 exprimant la pyruvate carboxylase et produisant de l'intérféron-α2β ont été utilisées dans le cadre de ce projet. L'objectif principal était de maximiser la croissance de ces cellules et le rendement des cultures en développant une stratégie cuvée-alimentée. Des cultures en flacons en mode batch ont tout d'abord permis de mettre en évidence les différences métaboliques entre la lignée parentale (293-D9) et la lignée exprimant la pyruvate carboxylase (293-F5). Tel qu'attendu, les taux de consommation du glucose et de la glutamine ainsi que le taux de production du lactate ont été réduits de façon significative dans le cas des cellules 293-F5. De plus, la concentration cellulaire maximale atteignait le double de celle observée avec les cellules parentales. Des cultures à petite échelle ont permis d'établir que l'emploi d'une solution d'alimentation commerciale (Effecientfeed, Invitrogen Life Technology), couplée à l'ajout de glutamine, s'avérait la combinaison la plus apte à maximiser la croissance cellulaire parmi les conditions testées. En appliquant une stratégie de contrôle prédictif en flacons, la concentration maximale de cellules 293-F5 a été encore augmentée à près de 10x106 cells/ml en plus de prolonger le maintien de la viabilité cellulaire. Pour les cellules 293-D9, la phase de croissance exponentielle n'a pas été prolongée et les effets ont été limités à une augmentation de la longévité de la culture. Malgré tout, la concentration finale d'interféron est demeurée plus élevée pour l'ensemble des cultures réalisées avec la lignée parentale, la productivité spécifique de ces cellules s'avérant supérieure. Par la suite, des expériences batch en bioréacteur ont permis d'obtenir une concentration cellulaire maximale 1,4 fois supérieure pour les cellules exprimant la PYC. La viabilité de la culture a été maintenue 2,5 jours de plus, ce qui s'est toutefois traduit par une augmentation modeste (7%) de la concentration finale d'interféron. Enfin, le maintien d'un point de consigne sur la concentration de glucose en implantant une boucle de contrôle complètement automatisée a permis d'optimiser davantage la croissance et la production. Pour les cellules 293-F5, la stratégie appliquée à conduit à une concentration cellulaire maximale de 10,7 x106 cellules/ml et la quantité cumulative de biomasse (intégrale de la concentration de cellules viables) était 2 fois plus élevée que celle de la culture en mode cuvée. La concentration finale de produit a atteint 160 mg/L ce qui représente une amélioration d'un facteur 4 par rapport au mode batch pour le même clone (61 mg/L) ainsi que pour la lignée parentale (57 mg/L). Le même protocole d'alimentation appliqué aux cellules parentales a eu un effet néfaste sur la production, probablement causé par l'inhibition du lactate qui a atteint une concentration très élevée dans ce cas. Des études dans la littérature ont associé l'expression de l'enzyme PYC avec une activité accrue du cycle de Krebs. Toutefois, des taux de consommation spécifique d'oxygène similaires entre les deux lignées ont été mesurés, suggérant que l'effet de la PYC sur le métabolisme se limite surtout au niveau des réactions cytosoliques.

Abstract

The market for biologics is growing fast. To meet this increasing demand, bioprocess development must allow to produce sufficient material for clinical trials or the market in a timely and cost effective manner. Most biologics are currently produced in mammalian cells because they are able to produce correctly folded and glycosylated proteins. However, animal cells exhibit low product yields due to lower cell density and productivity. The human origin of HEK293 cells makes them an advantageous production platform for recombinant protein production as they can perform proper post-traductional modifications. In industrial bioprocesses, fed-batch is widely used because it is simple, flexible and easily scalable. Foremost, by maintaining cell viability for extended periods of time and avoiding nutrient depletion, higher product titer can be achieved. Waste metabolite accumulation is the main limitation in most fed-batch cultures. In order to reduce lactate and ammonia production, metabolic engineering can be used. In this thesis, HEK293 cells stably producing interferon-α2β and further engineered to overexpress yeast pyruvate carboxylase were used. The aim was to maximize cell growth by using fed-batch technology. Batch shake flask cultures were conducted with both cell lines to serve as controls and also to highlight the main differences between the parental (293-D9) and PYC expressing (293-F5) clones. A marked reduction of glucose and glutamine uptake, as well as a decrease of lactate production were observed for PYC expressing cells. Maximum cell density was also increased 2-fold compared to parental cells. Of all the feeding solutions tested, the commercially available Effecientfeed (Invitrogen Life Technology) solution supplemented with glutamine led to the highest increase in cell growth and was used thereafter. A simple predictive control strategy in shake flasks increased the maximum cell density up to 10x106 cells/ml and extended culture longevity. In the case of parental cells, only minor improvements of cell growth were observed, but cell viability was maintained longer. The increase in growth did not, however, translate to a higher product titer. A bioreactor experiment carried out in batch mode led to a 1.4-fold increase in maximum cell density and the culture duration was extended by 2.5 days for PYC expressing cells compared to 293-D9. These combined factors led to a negligible increase in product titer by 7%. Significant increases in cell growth and production concentration were achieved when glucose was maintained at a set-point by an automatic control loop for the metabolically-engineered cells. In contrast, under the same conditions, parental cells produced less recombinant protein despite a similar growth curve when compared to batch. The lower product titer was most likely caused by the high lactate concentrations observed in this case, creating unfavorable conditions for production. For 293-F5 cells, the strategy yielded 160 mg/L of interferon mainly resulting from a 2-fold increase of the integral of viable cells (IVC) when compared to the batch process. The bioreactor run was therefore able to produce 260% more recombinant protein than the initial shake flask control in batch. The metabolism of PYC expressing cells metabolism was more efficient than the one of parental cells in all culture conditions tested. However, a similar cell specific oxygen uptake rate measured for the two clones suggests that the PYC enzyme effect may be mostly limited to the cytosol.