Optimisation en ligne des expériences réalisées à l'aide de biocapteurs dont le principe de détection est la résonance plasmonique de surface

Durant les deux dernières décennies, les biocapteurs utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR) à des fins de détection se sont imposés comme une méthode de choix pour l'étude cinétique des interactions entre biomolécules. Ces biocapteurs sont reconnus pour leur fiabilité et leur robustesse lorsqu'utilisés pour identifier les constantes cinétiques qui régissent les interactions des molécules à l'étude. Afin d'intégrer cette technologie aussi tôt que possible dans le processus de découverte de nouveaux composés thérapeutiques, de nouveaux instruments SPR à haute vitesse de criblage ont été développés. Cependant la justesse des constantes cinétiques identifiées avec ces nouveaux instruments est faible comparativement aux biocapteurs SPR classiques. Avec ces derniers, une expérience cinétique traditionnelle implique l'immobilisation de l'une des deux molécules à la surface du biocapteur et l'injection de 5 à 10 échantillons de son partenaire biologique au dessus de la surface fonctionnalisée. Il a été prouvé que deux injections soigneusement choisies peuvent conduire à l'identification des constantes cinétiques de manière aussi fiable qu'en réalisant les 5 à 10 injections décrites précédemment. Fort de cette constatation, notre laboratoire a développé un algorithme basé sur une optimisation numérique sous contrainte et l'identification de paramètre pour choisir ces deux injections, et donc augmenter la vitesse de criblage des biocapteurs SPR. Afin de réduire les temps de criblage de large bibliothèques de composés, nous avons développé une méthode publiée en 2012 dans Journal of Molecular Recognition, qui améliore les performances de l'algorithme d'optimisation. Cette méthode est basée sur l'injection simultanée de deux composés sur une surface où leur partenaire biologique a été précédemment immobilisé. Le modèle cinétique proposé a été validé expérimentalement à l'aide d'un système biologique modèle très bien documenté dans la littérature. Ce système correspond aux interactions entre l'anhydrase carbonique (isozyme II) et plusieurs composés de faibles poids moléculaires. Une fois le modèle validé nous nous sommes intéressés à l'optimisation de cette méthode. L'algorithme d'optimisation mis en place se base sur une première injection non optimisée de chacun des composés pris séparément. Les constantes cinétiques calculées sont alors utilisées pour déterminer les injections optimales à réaliser en combinant les deux composés. La mise en œuvre expérimentale de cet algorithme nous a permis de réduire de façon significative le temps d'expérience et la consommation de matériels par un facteur supérieur à 2,6 et 3,3 respectivement. L'introduction de cette méthode a cependant soulevé des questionnements car des écarts de l'ordre de 17 % sur les paramètres cinétiques (lorsque comparés à ceux déterminés avec la méthode classique) avaient été observés. Bien qu'acceptables, ces déviations se trouvent être supérieures aux déviations rapportées pour deux expériences classiques entièrement indépendantes. Nous avons alors émis l'hypothèse que la source de ce biais résidait dans le fait que l'incrément de l'indice de réfraction des molécules de faible poids moléculaire, et par ricochet le signal SPR associé, peut varier grandement d'une molécule à l'autre. Ce phénomène ne pose aucun problème quand le mode expérimental classique est adopté avec des biocapteurs SPR puisqu'un seul composé est injecté. Cependant, pour éviter tous biais sur les constantes cinétiques déterminées lorsque deux composés sont injectés simultanément, le signal enregistré par l'instrument doit être analysé en pondérant la contribution de chacun des composés en fonction de l'incrément de l'indice de réfraction qui lui est propre. Partant de ce nouveau constat, nous avons construit un modèle qui décrit parfaitement les interactions. En effet, l'analyse de onze cas expérimentaux différents avec notre nouveau modèle a montré que les déviations sur les constantes cinétiques étaient inferieurs à 10 %, rejoignant ainsi les déviations observées entre expériences classiques indépendantes. Nos résultats sont résumés dans un manuscrit soumis au journal Analytical Biochemistry. Les algorithmes d'optimisation développés dans notre laboratoire se sont avérés très efficaces pour augmenter la vitesse de criblage des biocapteurs SPR: ils réduisent drastiquement le temps d'expérience et la consommation de matériel. Ces algorithmes sont construits pour des interactions décrites par un modèle cinétique simple (modèle de Langmuir). Cependant, ce modèle n'est pas applicable à toutes les interactions puisqu'il n'inclut pas une limitation potentielle des cinétiques biologiques par transfert de masse. Cette limitation a été rapportée maintes fois lorsque les cinétiques biologiques sont rapides. Ainsi, si un modèle simple est utilisé quand l'interaction est influencée par la limitation par transfert masse, les constantes cinétiques identifiées sont biaisées. Dans le cinquième chapitre de cette thèse, nous avons présenté une méthode visant à minimiser la durée des expériences menées avec les biocapteurs SPR tout en choisissant le modèle approprié qui décrit l'interaction. La méthode proposée évite la détermination de constantes cinétiques biaisées tout en minimisant la collecte de données inutiles. Nos résultats, soumis au Journal of Molecular Recognition démontrent que cet algorithme ne rallonge pas de façon significative le temps d'expérience lorsque comparé à l'algorithme d'optimisation initial basé sur un modèle cinétique simple uniquement.

Abstract

Within the last two decades, surface plasmon resonance - based biosensor experiments (SPR) for detection became a method of choice for the study of interaction between biomolecules. These biosensors are well known for their robustness and reliability when used to identify the kinetic parameters of interacting molecules. In effort to integrate this technology as early as possible in the process of drug discovery, new high throughput instruments were developed. However the confidence on the identified kinetic parameters with these tools is poor when compared to the classical SPR biosensors. A classical SPR experiment implies the immobilisation of one of the interacting molecules at the surface of the biosensors and the injection of 5 to 10 samples of the biological partner over the functionalized surface. It has been proven that two injections carefully chosen can allow the identification of kinetic parameter with a comparable confidence to an experiment with 5 to 10 injections. Based on this observation, our laboratory developed an algorithm based on numerical optimization under non-linear constraint and parameter identification to choose these two injections to improve the throughput of the SPR biosensors. To improve the screening of large library compounds, we developed a method published in 2012 in the Journal of Molecular Recognition, that improves the performances of the optimization algorithm. This method is based on simultaneous injection of two compounds through a surface where their binding partner has been previously immobilized. The proposed kinetic model was experimentally validated by well-documented biological system in the literature. This system corresponds to interactions between the carbonic anhydrase isozyme II (CAII) and its various low molecular weight inhibitors. Once the model validated we optimized the method. The proposed algorithm is based in on a first non-optimized injection of each analyte separately. The computed kinetic parameters are then used to predict optimal injection to perform by injecting the analytes simultaneously. The experimental implementation of this algorithm reduces significantly the experimental time and material consumption by factor superior to 2.6 and 3.3 respectively. However, the introduction of this method raised some interrogations because some observed deviations on kinetic parameters were about 17 % (when compared to those identified with a classical method). Although acceptable, such a deviation is higher than that reported for independent duplicates, i.e. less than 10 %. We assumed that the source of this error could be the fact that the refractive index increment (RII) varies widely from a molecule to an other in case of low molecular weight compounds. This phenomenon does not influence the classical experiments because only one compound is injected. Whereas, to avoid any error in the kinetic parameter when two compounds are injected simultaneously, the signal must be weighted by the contribution of each compound in function of its own RII. Based on this assumption, we constructed a model that describes perfectly the interaction. Indeed, the analyze of eleven different experimental cases with this model shows that the deviations on kinetic parameters are inferior to 10%, as it is observed for independent classical experiments. Our results are submitted to the journal Analytical Biochemistry. The algorithms developed in our laboratory are a efficient to improve the throughput of the SPR biosensors: they reduce drastically the experimental time and material consumption. These algorithms are designed for interaction following a simple kinetic model. However, this model is not applicable for all the interactions, as it does not include a potential mass transfer limitation. This limitation takes place when the kinetics are fast. Indeed, if the simple model is used when the interaction is mass transfer limited than the identified kinetic parameters will be biased. In the fifth chapter of this thesis, we presented a method to reduce the experimental time of SPR biosensors while choosing the more appropriate model for the interaction under study. The proposed method avoids biased kinetic parameter and unnecessary data collection. Our results, submitted to the Journal of Molecular Recognition show that this algorithm does not extend significantly the experimental time when compared to the initial algorithm of optimization based on a simple model only.